3 Методы определения соматических клеток

3.1 Экспресс-метод определения соматических клеток в молоке на молочно-контрольных пластинках с применением препарата «беломастин.

3.1.1 Для проведения анализов используются молочно-контрольные пластинки МКП-1 или МКП-2, а также препараты типа «беломастин» согласно действующим ТНПА.

3.1.2 Реакция основана на способности «беломастина» образовывать гель с молоком, содержащим соматические клетки.

3.1.3 В углубление пластинок МКП-1 или МКП-2 (можно использовать пенициллиновые флаконы, пробирки) вносят по 1,0 см³ рабочего раствора «беломастина» и перемешивают стеклянной палочкой или путем горизонтального вращения. Рабочий раствор «беломастина» готовят добавляя к препарату дистиллированную или кипяченую воду в соотношении 1:3. Срок использования рабочего раствора 8 месяцев.

3.1.3 Результаты реакции учитывают в первые 10-20 сек.:

3.1.3.1 реакционная смесь остается жидкой, однородной - в сборном молоке содержится соматических клеток до 500 000 в 1 см³;

3.1.3.2 в смеси образуются хлопья или слизистые тяжи - в молоке содержится соматических клеток от 500 000 до 1 000 000 в 1 см³, в) в смеси образуется тягучая слизистая масса или желеобразный сгусток – в молоке содержится соматических клеток более 1 000 000 в 1 см³.

3.2 Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением вискозиметров ВМЛК и ВМП.

3.2.1 Аппаратура, материалы.

- Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 500 г, по ГОСТ 24104;

- Вискозиметр ВМЛК, ВМП;

- Пипетки 2-2-5, 2-2-10, 3-2-5,3-2-10 по ГОСТ 20292;

- Колбы 1-100-2, 2-100-2,3-100-2,4-100-2 по ГОСТ 1770;

- Цилиндры 1-100,2-100, 3-100,4-100 по ГОСТ 1770;

- Термометры стеклянные технические прямые № 4 по ГОСТ 2823;

- Стаканы 1-5 ТС, 1-600 ТС, 2-50ТС, 2-600 ТС по ГОСТ 25336;

- Препарат «Мастоприм» по ГОСТ 23455;

- Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода питьевая по ГОСТ 2874 свежекипяченная.

3.2.2 Приготовление водного раствора «Мастоприм»: 3,5 г препарата вносят в мерную колбу или мерный цилиндр вместимостью 100 см³ и доливают до метки дистиллированной водой, подогретой до 30-35^оС. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка. Срок годности раствора 24 ч при комнатной температуре.

3.2.3 Проведение анализа.

Налить в сосуд прибора 5 см³ водного раствора препарата «Мастоприм» и 10 см³ исследуемого молока, тщательно профильтрованного через четыре слоя марли и перемешанного.

Смесь молока с раствором препарата «Мастоприм» перемешивают в течение 30 сек. отклонениями рабочего сосуда от вертикальной оси или с помощью автоматического устройства.

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по времени вытекания смеси в соответствии с таблицей 5.

Таблица 5

Содержание соматических клеток в молоке по показателям времени вытекания смеси в вискозиметре

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое резуль­татов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать в секундах: для времени вытекания смеси от 12,0 до 18,0 сек – 1; от 18,1 до 25,0 – 2; от 25,1 до 31,0 – 3; от 31,1 до 37,0 – 4; от 37,1 до 46,0 – 5: от 46,1 до 58,0 – 6.

Предел допускаемой погрешности результатов измерений составляет 10 % в интервале доверительной вероятности р = 0,95.

После проведения анализа смеси для каждой исследуемой пробы сосуд следует два-три раза промыть дистиллированной водой и четыре-пять раз продуть с помощью резиновой груши.

3.3 Количественный учет соматических клеток в молоке с применением электронных устройств типа «Соматос», «Фоссоматик» и других.

3.3.1 Анализатор вискозиметрический «Соматос» обеспечивает экспрессное определение соматических клеток в молоке. Применяется для контроля молока в лабораториях предприятий молочной промышленности в соответствии с ГОСТ 23453-90, согласно инструкции на устройство.

Диапазон измерений количества соматических клеток 90-1500 тыс./см³. Предел основной погрешности условной вязкости 5%. Средняя продолжительность одного измерения – 4 мин. Потребляемая от сети мощность (220 В 50 Гц) не более 70 ВА. Габаритные размеры 380х270х200, масса – 9 кг.

3.3.2 Электронный счетчик соматических клеток «Фоссоматик 6000». Работа прибора основана на флуорооптическом методе регистрации: ДНК в соматических клетках окрашивается красителем (этидбромидом), обладающим люминесцентными свойствами. Окрашенная ДНК облучается источником возбуждающего света видимого диапазона, поглощает свет на данной длине волны и испускает люминесцентное излучение на большей длине волны в видимом диапазоне.

Электронная оптическая система, работающая на принципе спектрометра видимого диапазона, обнаруживает импульсы, испускаемые ДНК клеток. Обнаруженные сигналы передаются в программу РС, где данные собираются и анализируются. Результаты представляются как число соматических клеток (SСС) (х 1000 мл молока).

Диапазон измерений количества соматических клеток – до 10 000 000 клеток в 1 см³. Скорость измерений 360 образцов в час. Расход молока 2,6 см³ Габаритные размеры установки 65х80х55 см, вес 100 кг. Потребляемая мощность установки 95–130 или 195–260 В, переменный ток, 50–60 Гц.

3.4 Камерный метод

3.4.1 Для подсчета соматических клеток в молоке в лабораторных условиях под микроскопом используют счетные камеры Фукса-Розенталя, Горяева и др.

3.4.2 В пробах молока вначале производят растворение жировых шариков солюбилизирующим раствором.

3.4.3 Для подсчета соматических клеток в пробирки, содержащие 4,9 см³ солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 см³ молока, тщательно перемешивают и прогревают 30 минут на водяной бане при 80^оС. После перемешивания каплю жидкости вносят под притертое покровное стекло счетной камеры.

3.4.4 Подсчет клеток ведут под микроскопом при объективе 10х20. В поле зрения на прозрачном фоне видны окрашенные клетки, легко поддающиеся подсчету. Если при этом выявлено повышенное содержание соматических клеток в сборном молоке (от 500 000 в 1 см³ и более), то всех лактирующих коров стада исследуют на мастит индивидуально.

3.4.5 В камере Фукса-Розенталя проводят подсчет клеток на площади всей камеры. Полученное количество клеток в камере умножают на коэффициент 15625, что соответствует количеству соматических клеток в 1 см³ молока. При использовании камеры Горяева подсчет соматических клеток ведут в 100 больших квадратах. В этом случае полученное количество клеток умножают на коэффициент 125000.

3.5 Метод Прескотта и Брида.

3.5.1 Чистое предметное стекло кладут на лист бумаги, расчерченной на квадраты, сторона которых составляет 1 см. Пробу молока (секрета) перемешивают, затем микропипеткой наносят на каждый квадрат предметного стекла 0,005 см³ молока (секрета) и тщательно распределяют на площади квадрата.

Вместо метода по Романовскому-Гимза мазки можно окрашивать по Ньюмансу: спирт абсолютный – 50 см³, ледяная уксусная кислота – 20 см³, хлороформ – 50 см³, фуксин основной – 0,1 г, метиленовая синь – 1,0 г. Краски растворяют в смеси спирта и хлороформа, нагретой до 60°С. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют ледяную уксусную кислоту и выдерживают в течение 18 часов, а затем используют для окрашивания. После окрашивания препарат промывают трехкратно теплой водой (37–40°С). Мазок тщательно высушивают и просматривают под микроскопом.

3.5.2 В каждом мазке просматривают 100 полей зрения. Подсчитанное количество клеток умножают на коэффициент с учетом объектива и окуляра: для микроскопа при объективе 90 и окуляре 7 этот коэффициент равен 6260, при окуляре 10–10200, при окуляре 15–33200.