1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам

История развития референтных методов определения чувствительности насчитывает порядка 20 лет. Однако до этого дня основными были методы нестандартизованных серийных разведений и диско-диффузионные методы.

–Европейский коммитет по исследованию противомикробной чувствительности).

CLSI в 1992 году разработал первый вариант протокола метода разведений в жидкой питательной среде M27-P. Время проведения исследований этим методом составляло 48 – 72 часа [74]. Благодаря совершенствованию протокола в 2008 году был предложен готовый протокол M27-A3 с дополнением S3, где время получения результата составляло 48 часов [47]. Данный метод является референтным методом определения чувствительности. Однако, несмотря на точность получаемых результатов, является трудозатратным и дорогим. В связи с этим, в 2004 году был разработан протокол диско-диффузионного метода CLSI M44-A [46],

характеризующийся простой пробоподготовкой, автоматическим учетом результата и высокой сопоставимостью результатов с референтным методом CLSI M27-A3.

В системе EUCAST также предложили вариант определения чувствительности дрожжей методом микроразведений в жидкой питательной среде (протокол Edef 7.2 Revision), однако время получения результата составило 24 часа, а не 48 - как у CLSI [75]. На протяжении нескольких лет между двумя центрами CLSI и EUCAST шли дебаты относительно критериев интерпретации минимальных ингибирующих концентраций, и лишь в 2012 году они были гармонизированы [48].

С развитием референтных методов стали появляться коммерческие аналоги: ручные тест-системы – MICRONAUT –AM, SensititreYeastOne (Trek Diagnostics), E – test (AB Biodisk), ATB Fungus 2 (bioMerieux) и автоматические – Vitek (bioMerieux), MicroScan WalkAway (Siemens) для удобства применения в практике.

В исследовании 133 изолятов Candida spp. отмечали, что совпадение между этими системами для флуконазола составляет 82,7%, для триазолов (72,9 – 77,9%) [28]. При сравнении результатов чувствительности к антимикотикам 170 изолятов C. albicans, полученных тест-системой

MICRONAUT – AM с протоколам CLSI A27-A3, EUCAST, было обнаружено, что все изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу и вориконазолу в сравнении с CLSI A27–A3, и 2% обладали промежуточной чувствительностью к флуконазолу по сравнению с EUCAST [107]. Многоцентровое исследование по сравнению МПК противогрибковых препаратов изолятов Candida spp., с использованием автоматической системы Vitek2 Compact и референтного метода микроразведений по протоколу CLSI M27–A3, показало, что совпадение между результатами вышеуказанных методов составило 99,5% (n=867) в отношении каспофунгина, 98,6% (n=867) – микафунгина и позаконазола - 95,6% (n=452) [127].

Таким образом, в начале XXI века остается проблема быстрой, точной идентификации и определения чувствительности к противогрибковым препаратам Candida spp. в клинической микробиологической лаборатории. В таблице 3 приведена эволюция методов диагностики в микробиологии.

Таблица 3 – Эволюция методов диагностики, применяемых в микробиологии по Khardori N. [92].

Продолжение таблицы 3

В настоящее время перспективным направлением в определении чувствительности к противогрибковым препаратам является устойчивость к ним с помощью молекулярно-биологических методов [31]

Один из них основан на масс-спектрометрии [104].

Известно, что при помощи масс-спектрометрии находят особенности белковых профилей, свойственные устойчивым штаммам микромицетов [138]. Такой подход можно назвать типированием. Следует отметить, что по литературным данным, подавляющая часть клинических изолятов вида C. parapsilosis sensu lato является чувствительной к противогрибковым препаратам: флуконазолу, миконазолу, итраконазолу и нистатину [38], флуконазолу и вориконазолу [25].

Методы, основанные на масс-спектрометрии, позволяют получить результат за непродолжительное время — три часа по оценкам Постераро с соавторами [23].

Также их несомненным достоинством является возможность одновременного определения видовой принадлежности возбудителя и его лекарственной устойчивости. Несмотря на это, разработка методов определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанных на масс-спектрометрии, в частности, в отношении грибов рода Candida, ещё не завершена [139].

Ещё одним новшеством, которое появилось сравнительно недавно, стали методы определения чувствительности к противогрибковым препаратам, основанные на изучении геномных последовательностей. Здесь функциональный подход связан с изучением путей воздействия противогрибковых препаратов на клетку и механизмов устойчивости к ним.

Существует несколько механизмов, по которым грибы вырабатывают устойчивость к действию лекарственных препаратов группы азолов. Во- первых, это пути, связанные с индукцией мембранных переносчиков семейств ABC (ATP-binding cassette) и MFS (Major Facilitator Superfamily). На первой стадии развития устойчивости соответствующие транскрипционные факторы связываются с промоторами генов этих белков, что приводит к повышению их экспрессии, увеличении числа переносчиков в клеточной мембране, и ускоренному выводу лекарственных веществ из цитоплазмы клеток гриба. С увеличением времени воздействия антимикотика гены транскрипционных факторов приобретают ряд мутаций. Аминокислотная последовательность транскрипционных факторов меняется таким образом, что они становятся постоянно связанными с промоторами генов мембранных переносчиков [145]. Во-вторых, за приобретение микромицетами

устойчивости к воздействию азолов отвечают механизмы, ассоциированные с ферментом CYP51. Ген CYP51 приобретает мутации. Аминокислотные замены в цитохроме ухудшают связывание с молекулами лекарственного препарата, активность же фермента меняется незначительно, что позволяет грибу в присутствии молекул лекарства в цитоплазме поддерживать приемлемую концентрацию эргостерола на мембране. Различные мутации в гене CYP51 могут быть коррелировать с развитием устойчивости к различным соединениям азольного ряда [146]. Также существуют изменения в транскрипционной регуляции экспрессии гена цитохрома, по подобию тех, которые были упомянуты для мембранных насосов. Они приводят к увеличению количества цитохрома на мембране клеток гриба и к повышению эффективной дозы лекарства. Интересно, что приобретение гиперактивного аллеля транскрипционного фактора белка CYP51 связано со снижением общей жизнеспособности и вирулентности патогена [57].

Эффекты мутаций, приводящих к изменению восприимчивости гриба к препарату азольного ряда и выраженные в МИК, арифметически суммируются [80]. Ещё один, менее распространённый у грибов рода Candida механизм устойчивости связан с мутационной инактивацией фермента Erg3: нарушение работы CYP51 не вызывает накопления токсичного стерола [19].

Мишенью препаратов эхинокандинового ряда так же, как и азолов, является поверхность клетки. Однако в случае с эхинокандинами это не липидный, а полисахаридный компонент. Эхинокандины ингибируют 1,3-β- D-глюкан-синтазу. Это приводит к нарушению структуры клеточной стенки и лизису дрожжей и аберрантному гифальному росту у плесеней. Устойчивость грибов рода Candida к эхинокандинам обусловливается мутациями в гене, кодирующем элементы 1,3-β-D-глюкан-синтазного комплекса. Эти мутации приводят к значительному повышению МПК по сравнению с изолятами дикого типа. Мутации в гене 1,3-β-D-глюкан-синтазы

приводят к появлению устойчивости против всего класса эхинокандинов одновременно [125].

В литературе нет единодушного мнения по вопросу перспективности для клинической практики комплекса методов определения чувствительности к антимикотикам, основанных на изучение геномных последовательностей, хотя ряд ученых видят за ними будущее персонифицированных подходов к антифунгальной терапии [31]. Также следует отметить, что прямое или косвенное определение МПК не позволяет предсказать результат лечения. А вот обнаружение некоторых мутаций в генах, кодирующие белки-мишени воздействия антимикотических преапаратов, позволяет это сделать. Но для успешного применения этого подхода необходима разработка быстрых и эффективных методов определения мутаций [142]. Их примерами могут послужить ПЦР-РВ, ПДРФ, SPR-технология, методы ДНК-чипов и масс-спектрометрии [1, 10, 63, 84,

112].

Анализ полиморфизма рибосомальных межгенных транскрибируемых спейсеров (ITS), последовательности локуса D1/D2 гена большой рибосомальной субъединицы, последовательности гена бета-тубулина, являющиеся в настоящее время «золотым стандартом» видовой диагностики микромицетов, позволяющие изучать филогенетические отношения между близкородственными видами, а также изучать филогению между популяциями внутри вида и между отдельными видами, рассматривается и как предикторы проявления резистентных качеств изолятов грибов к антимикотической терапии.. В частности, Маккаллу с соавторами удалось соотнести генетические варианты C. albicans, определённые методом ПДРФ, с проявлением устойчивости к флуцитозину [104]. Аналогичные данные (по флуцитозину, но не по флуконазолу и итраконазолу) методом мультилокусного секвенирования-типирования для гриба того же вида получены в работе Таванти с соавторами [131]. Для рода Aspergillus с помощью молекулярно-филогенетических подходов описаны виды, не

различающиеся по морфологии, но проявляющие различную восприимчивость к противогрибковым препаратам [19]. Эти примеры показывают возможную перспективность изучения разнообразия геномных последовательностей, используемых ранее для типирования, грибов рода Candida, в частности локуса D1/D2 гена 28S рРНК, для выявления резистентных изолятов.

Таким образом, в связи с актуальностью проблемы, выбор оптимальных методов определения чувствительности для применения в рутинной практике имеет решающее значение, особенно для пациентов с внутрибольничным ИК.