Методические рекомендации по определению количества микробных клеток в исследуемом материале

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/132)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, С.А.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации регламентируют определение количества микробных клеток, для диагностических ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел.

Определять количество клеток можно в счетных камерах, в окрашенных препаратах. Эти методы особенно ценны, если отсутствуют показатели применительно данного микроорганизма, позволяющие использовать косвенный подсчет при помощи стандарта мутности, нефелометрии.

Определение общего количества микробных клеток в счетных камерах

Обычно используют камеру Горяева-Тома, которая представляет толстое предметное стекло, разделенное бороздами. В центральной части стекла есть сетка, площадью одного большого квадрата составляет 1/25 мм², малого – 1/400 мм². Площадка с сеткой находятся на 0,1 мм ниже остальных частей стекла (глубина камеры). В ходе работы сначала притирают шлифованное покровное стекло со стороны камеры до появления колец Ньютона. Исследуемую суспензию бактерий вносят через бороздку камеры пипеткой. Подсчет начинают через 3-5 минут после заполнения камеры. Это время необходимо для оседания клеток, когда они окажутся в одной плоскости. Подвижные или патогенные клетки предварительно убивают формалином или нагреванием. Рассматривают содержимое камеры в микроскоп, используя объектив х8, х40, т.е. можно обнаруживать достаточно крупные объекты — дрожжи, конидии, грибы. При использовании данной камеры работать с иммерсионным объективом нельзя, т.к. его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры.

Камера Хауксли позволяет работать с иммерсией.

Сначала проводят предварительный подсчет клеток. Если концентрация клеток чрезмерно высока (более 3х10⁸ мл), то суспензию разводят раствором Норриса-Пацелла: 1000 мл воды, 5 мл 40%-ного формальдегида, устанавливают рН с помощью Nа₂НР0₄ на уровне 7,2-7,4. Затем к пробе добавляют равное количество NН₄С1, что в результате вызывает ги бель клеток, появление у них положительного заряда, и, как следствие, они адсорбируются на стекле.

Рекомендуется подсчитывать не менее 600 клеток в 10 больших или 20 малых квадратах, повторяя подсчет 3-4 раза. Количество клеток рекомендуется подсчитывать всегда в одних и тех же квадратах, например 4-х угловых и в квадратах по диагонали. Количество клеток определяют по формуле:

М= (а · 10³/h)·n, где

М — количество бактерий в 1 мл;

а — среднее число клеток в квадрате;

h — высота камеры в мм;

S — площадь квадрата сетки в мм²;

10³ — коэффициент перевода см³ в мм³;

n — разведение исследуемой суспензии.

Определение общего количества клеток в фиксированных окрашенных мазках (метод Брида)

Хорошо обезжиренное предметное стекло кладут на листок миллиметровой бумаги, на которой отмечен квадрат площадью 1см² (или более). Смешивают равные объемы взвеси бактерий и 0,03-0,1% водного агара с температурой 45°С. Микропипеткой на стекло наносят точно измеренный объем взвесей, например 0,01 мл, равномерно распределяют по отмеченной площади, подсушивают, фиксируют этанолом (96°) 10-20 минут, окрашивают 1-2 минуты фуксином Циля, промывают, подсушивают, микроскопируют.

Используют окулярную сетку, расположенную между собирательной и глазной линзой. Подсчитывают клетки в 50-100 полях зрения, но не менее 600 клеток, и определяют их содержание в 1 мл взвеси по формуле:

М = (аS/sV) · n, где

М — количество бактерий в 1 мл взвеси;

а — среднее число клеток в квадрате окулярной сетки;

s — площадь квадрата окулярной сетки в 1 мм²;

V — объем взвеси бактерий;

S — площадь мазка в мкм²;

n — разведение взвеси бактерий.

Определение количества клеток нефелометрическим методом

Метод пригоден при работе с бактериями, которые растут с равномерным помутнением среды без образования пленок или каких-либо других скоплений клеток. Количество света, рассеиваемого суспензией бактерий, пропорционально их концентрации (числу клеток) или средней длине бактерий. Зависимость между интенсивностью падающего света «I_o» и прошедшего света «Т», описывается формулой:

I = I_o· 10^-elc, где

e — коэффициент экстинкции;

l — толщина слоя суспензии;

с— концентрация бактерий, откуда следует, что lg (I/I_o) = -elc или lg (I_o/I) = elc.

Величина lg (I/I_o) называется оптической плотностью или экстинкцией. Изменение оптической плотности, вызываемое изменением концентрации, зависит от толщины слоя суспензии (l) и свойств суспензии, характеризуемых коэффициентом e, который различен для бактерий разных видов, поэтому для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости между оптической плотностью и концентрацией бактерий.

Питательная среда, на которой выращивают микроорганизмы, должна быть оптически прозрачной. Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют при помощи спектрофотометра или фо-тоэлектроколориметра, обычно с длиной волны 540-650 нм. Для измерений культур в МПБ подходит красный фильтр. Суспензии большой плотности следует разводить средой. При построении калибровочной кривой измеряют величину светорассеивания суспензий с различным содержанием клеток. Для этого делают серию разведений хорошо перемешанной суспензии. Интервалы разведений должны быть не очень большими. Для калибровки в абсолютных единицах необходимо точно измерить количество клеток в исходной суспензии, поскольку именно этот этап работы определяет точность результатов в дальнейшем. Измеряют величину светорассивания суспензий с различным содержанием клеток, полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат коэффициент экстинкции, а на оси абсцисс — количество клеток в 1 мл суспензии.

В лабораториях широко используют так называемый «стандарт мутности», выпускаемый Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л А.Тарасевича. Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов на 5, 10, 20 единиц мутности. Мутность стандарта на 10 ед. соответствует следующим концентрациям бактерий: кишечная группа — 0,93·10⁹ мк/мл; бруцеллы — 1,7·10⁹ мк/мл; бордетеллы — 11·10⁹ мк/мл; возбудитель туляремии — 5·10⁹ мк/мл. Ход работы со стандартом мутности следующий. Например, в пробирку внесли 0,1 мл взвеси бактерий кишечной группы неизвестной концентрации. Для уравнивания оптической плотности исследуемой взвеси со стандартом мутности на 10 ед. в пробирку пришлось добавить 0,9 мл физиологического раствора. Сравнение оптической плотности (мутности) стандарта и пробирки с исследуемой взвесью проводят, рассматривая через них невооруженным глазом шрифт на специальной шрифтовой таблице, стоя спиной к свету. В данном примере исследуемую взвесь пришлось развести для уравнивания со стандартом в 10 раз, следовательно, в ней содержится 0,93·10⁹мк/мл · 10 =0,93·10¹⁰ мк/мл.

При работе с бактериями, для которых нет данных о содержании микробных клеток применительно «стандарта мутности», необходимо методом прямого счета определить их количество во взвеси, соответствующей по оптической плотности, например, стандарту на 10 ед., и в последующем Пользоваться этими показателями.

В случае необходимости можно приготовить стандарт мутности МсFarland, предварительно проверив с помощью отечественного стандарта, какой концентрации бактериальных клеток данного вида соответствует стандарт МсFarland. В запаянных пробирках этот стандарт пригоден для использования в течение 3 месяцев хранения в темноте при комнатной температуре.

Приготовление стандарта мутности по методу МсFarland. Раствор А: 1,75 г ВаС1₂·2 Н₂О растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор Б: 1,0 мл. Н₂SO₄ (уд. вес 1,84) растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Основной раствор: смешивают 0,5 мл раствора А и 99,5 мл раствора В, перемешивают, разливают по 4-6 мл в пробирки и запаивают.

Определение количества живых бактерий

Метод посева исследуемой взвеси бактерий на поверхность агара Готовят десятикратные разведения исследуемой взвеси бактерий. По 0,1 мл разведений культуры наносят на поверхность агара в чашках Петри, равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют, подсчитывают количество клеток в 1 мл взвеси по формуле:

М = (а·10ⁿ/V), где

М — количество клеток в 1 мл взвеси бактерий;

а — среднее число колоний, выросших при посеве данного разведения;

V — объем посеянной взвеси бактерий;

10ⁿ — коэффициент разведения.

Для получения достаточно точных воспроизводимых результатов необходимо при работе выполнять ряд требований.

- В ходе опыта использовать один коэффициент разведения, например 10^-1, путем добавления 0,1 мл культуры к 0,9 мл раствора.

- При работе с вегетативными клетками (из-за их адсорбции на стеклах пипетки) для каждого разведения использовать отдельную пипетку одного и того же объема и класса.

- Агар перед разливом в чашки Петри охлаждают до 45-50°С, что дает мало конденсата. Ели на поверхности агара возникают пузыри при разливе, то их убирают, направляя пламя горелки на агар. Агар подсушивают в чашках Петри при комнатной температуре в течение12-24часов.

- На количество выросших колоний влияет разбавитель. Разбавление водой или физиологическим раствором, с некоторым интервалом до посева (15 мин), может привести к двукратному уменьшению числа клеток. Желательным является использование забуференного сбалансированного солевого раствора, содержащего белок. Например, 0,01% желатины.

- Разведение готовят таким образом, чтобы имелись чашки Петри с оптимальным для подсчета количеством колоний (100-200 на чашку), хотя возможен подсчет в диапазоне 30-300 колоний.

- Не следует водить шпателем по поверхности агара после того, как суспензия уже всосалась, т.к это приводит к большому разбросу результатов.

Капельный метод посева взвеси бактерий на поверхность агара

Метод позволяет на одной чашке Петри проверить широкий диапазон разведений взвеси бактерий, что существенно при отсутствии каких-либо ориентировочных сведений о концентрации клеток. Метод желательно не использовать для определения количества быстро делящихся клеток, т.к. деление может произойти раньше, чем капля с бактериями адсорбируется агаром.

Разведения исследуемой взвеси бактерий отбирают специально калиброванной пипеткой и на поверхность хорошо подсушенного агара наносят капли взвеси строго определенного объема, например 0,02 мл. Пипетку при этом держат строго вертикально. Капли не растирают, можно только несколько увеличить их площадь, слегка покачивая чашку Петри. Посевы инкубируют и затем определяют количество выросших колоний. Калибровочные пипетки делают из стальных трубок или из стекла (пастеровская пипетка). В последнем случае пипетку вставляют в шаблон для калибровки проволоки, наносят напильником метку в месте контакта с шаблоном, затем делают надпил и отламывают кончик. Пригодны пипетки со строго вертикальным относительно оси пипетки разломом. Пипетки с наружным диаметром 1 мм дают капли объемом 0,02 мл. Объем капли строго пропорционален наружному диаметру пипетки.

Метод посева в многослойный агар

В чашку Петри наливают агаровую среду (1,5% агара) в количестве, дающем толщину слоя 0,4 см. В предварительно нагретые до 45°С пробирки вносят по 2,5 мл расплавленной 0,7%-ной агаровой среды, делают разведения исследуемой культуры, согласно вышеизложенным требованиям. На наружной поверхности пробирки с агаром делают отметину карандашом, и в эту зону на внутреннюю поверхность пробирки наносят 0,1 мл разведенной пробы. Сразу же после этого агар выливают из пробирки в чашки Петри таким образом, чтобы он смыл клетки бактерий, внесенные в пробирку. Чашку Петри покачивают до равномерного покрытия расплавленным агаром всей поверхности среды, затем посевы инкубируют и подсчитывают количество колоний. При определении количества анаэробных бактерий чашки Петри с посевом помещают в анаэростат. В случае работы со строгими анаэробами применяют технику Хангейта.

Определение количества живых клеток методом предельных разведений в жидкой питательной среде

Используют для определения количества бактерий, плохо растущих или не растущих на плотных питательных средах. Разведения исследуемой взвеси бактерий осуществляют как было описано выше. В пробирки наливают одинаковые объемы питательной среды. Посев производят из каждого разведения на 2-5 параллельных пробирок с питательной средой. Посевная доза должна быть во всех случаях одинаковой, например 1 мл. Посевы инкубируют столько времени, сколько необходимо для роста данного микроорганизма и учитывают наличие роста в пробирках по общепринятым критериям. При этом исходят из положения, что в пробирках, где нет роста, не было внесено ни одной микробной клетки.

Концентрация клеток определяется методом наиболее вероятных чисел, заключающемся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых уже не регистрируется рост. Разведение клеток подчиняется формуле Пуассона и среднее число клеток в разведении, где нет роста, вычисляют по формуле:

Р₀ = е^-m, где

m — среднее, Р₀ — отношение количества пробирок, где нет роста, к общему числу пробирок. Далее среднее умножают на фактор разбавления и объем инокулята, который дает заметный рост культуры. Для облегчения работы составлены специальные таблицы, при помощи которых можно, не прибегая к расчетам, определить наиболее вероятное число бактерий при параллельном засеве 2, 3, 4 и 5 пробирок (табл. 1).

Первая цифра слева в числовой характеристике показывает число пробирок в последнем разведении всех параллельных посевов, посев из которых дает рост во всех пробирках. Две следующие цифры показывают число пробирок, где есть рост из двух последних разведений. После учета результатов составляют числовую характеристику и по таблице 1 находят наиболее вероятное число бактерий, соответствующее этому значению числовой характеристики. Далее это количество клеток умножают на разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

Таблица 1

Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии

Пример определения количества бактериальных клеток