З.б.З.Получение 5'-аденозинфосфатов фосфорилированием аденозина ферментными системами пивных дрожжей

Аденозинтрифосфат (АТФ) используется в медицине для лечения сердечно-сосудистых заболе­ваний. Лекарственную форму АТФ выпускают для инъекций в виде 1 % -ного раствора натриевой соли АТФ или 3 % -ного раствора кальциевой соли АТФ.

В последнее время в медицине стали использовать аденозинмонофосфат (АМФ), известный за ру­бежом под названием «аденил». На основе АМФ разработан отечественный препарат фосфаден, ко­торый в виде таблеток или инъекционного раствора рекомендован для лечения различных заболева­ний сосудов, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, трофических язв, послеожоговых ран, склеротических заболеваний, хронических заболеваний печени и поджелудочной железы.

Из всех известных подходов к получению аденозинфосфатов наиболее перспективными являют­ся биотехнологические приемы, использующие ферментные системы микроорганизмов, которые фосфорилируют аденозин в среде, содержащей неорганический фосфат.

Для фосфорилирования аденозина наиболее подходят пивные дрожжи Saccharomyces carlsber- gensis. Получать таким образом аденозинфосфаты возможно в среде, содержащей аденозина — 10 г/л, сахарозы -20 г/л, хлоридов калия и магния по 0,8 г/л, ортофосфат — 0,20-0,25 М и 10 % дрожжей. Время биотрансформации аденозина варьирует от 1,5 до 6 ч и зависит от степени фосфо­рилирования субстрата. Из всех аденозинфосфатов первым образуется АТФ. Схема превращения аденозина под действием ферментов гликолиза приведена ниже:

В этой схеме Адо — аденозин, Ф„ — неорганический фосфат (РО₄³).

Выход АТФ в этих условиях достигает 80—85 %. Он зависит от начальных концентраций саха­розы и неорганического фосфата в среде. При их снижении наблюдается активация фосфатаз дрожжей, что приводит к увеличению выхода АМФ и АДФ.

Технологическая схема получения аденозинфосфатов приведена на рис. 19. В реактор 2 заг­ружают растворы сахарозы, аденозина и пивных дрожжей, а также растворы солей калия и магния из сборника 1. Фосфорилирование проводят при температуре 37-40 °С в течение 1,5-6 ч. В зависимости от условий биофосфорилирования конечными продуктами производства явля­ются АТФ или АМФ. По окончании процесса суспензия поступает на центрифугу 3, суперна­тант собирают в сборнике 4, а осадок пивных дрожжей для увеличения выхода аденозинфосфа-

Рис. 19. Технологическая схема получения аденозинфосфатов биофосфорилированием аденозина: 1,4,6,7,9,10, 17, 18,25 — сборник; 2,11,13,15,21 — реактор; 3 сепаратор; 5 — ультрафильтрационная установка, 8 — ионообменная колонна; 12, 16, 19, 22 — нутч-фильтр; 14 вакуум-выпарная установка;

20, 23 — вакуум-су шильный шкаф; 24 — ректификационная колонна

та промывают на центрифуге горячей (50 °С) водой с гидромодулем 1. Промытый осадок дрож­жей направляют на получение кормового продукта, а промывные воды объединяют с суперна­тантом в сборнике 4.

Полученный раствор аденозинфосфата мутный и окрашен в желтый цвет. Для получения проз­рачного раствора его направляют на ультрафильтрационную установку 5 с полыми волокнами, удерживающими молекулы массой выше 10-15 кДа.

Пермеат, содержащий аденозинфосфаты, объединенный с диафильтратами из сборника 7, нап­равляют на ионообменную колонну 8. В качестве сорбента используют анионит АВ-17-2 в С? — форме. На анионите сорбируются АТФ, АМФ и примесный АДФ. Для их разделения используют элюенты различного состава. Если целевым продуктом является АТФ, то элюцию проводят 0,08 н ЫаС1в0,01н НС1. При этом происходит практически полная десорбция АТФ. Элюат, содержащий АТФ, собирают в сборнике 9. Для элюции АДФ и АМФ через колонну последовательно пропуска­ют 0,05 н раствор NH₄C1 в 0,01 н НС 1 и 0,008 н раствор NH₄C1 в 0,001 нНС1. Степень десорбции аде- нозинфосфатов составляет не менее 96-98 %. Их собирают в сборнике 10. АТФ-содержащий элю­ат из сборника 9 поступает в аппарат 11, где проводят осаждение АТФ.

Осаждение аденозинфосфатов основано на том, что АТФ, АМФ и АДФ и хлорид аммония имеют различную растворимость в водно-спиртовой среде. При кристаллизации АТФ к раствору в реакто­ре 11 добавляют 80 об. % этанола из сборника 17 при температуре 4-6 °С и выдерживают 8-12 ч. Степень осаждения этих условиях составляет 88-92 %.

Кристаллы технического АТФ, содержащего до 30 % примесных солей, отделяют на нутч- фильтре 12. Для очистки от соли кристаллы АТФ растворяют в воде в аппарате 13, добавляют 77 % по объему этанола из сборника 17 и проводят перекристаллизацию при 4-6 °С в течение 8-12 ч. Кристаллы АТФ отделяют на нутч-фильтре 19, промывают этанолом и ацетоном и высушивают в вакуум-сушильном шкафу 20 при 25 °С до остаточной влажности не более 10 % в течение 4 ч.

Готовый препарат АТФ представляет собой порошок белого цвета и содержит не менее 98 % ос­новного вещества.

Для достижения технологически приемлемой степени осаждения АМФ из водно-спиртовых ра­створов необходимо, чтобы исходный раствор содержал не менее 20 г/л целевого продукта.

Выход АМФ на стадии кристаллизации составляет 78 %, а АДФ — 85 %. Водно-спиртовые сто­ки с фильтров 12,19,16, 22 собирают в сборнике 18, откуда они поступают на ректификационную колонну 24. Регенерированный этанол собирают в сборник 25 и повторно используют, а кубовый остаток из сборника 26 поступает на биосинтез кормовых дрожжей.

4.