Исследование in vitro биосовместимости матриксов на основе гибридной золь-гель-полимерной системы, содержащей Zr, полученных методом двухфотонной фотополимеризации

Для исследования биосовместимости матриксов были выбраны материалы, полученные методом двухфотонной фотополимеризации на основе гибридной золь- гель-полимерной системы, содержащей цирконий.

Диссоциирование нервных клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0,25-процентным трипсином. Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде NeurobasalTM (Invitrogen) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitro- gen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко). Диссоциированные клетки гиппокампа культивировали на матриксе, согласно разработанному протоколу (Мухина и др., 2009, Vedunova et al., 2013), в течение 14 дней in vitro (DIV). Контролем служили диссоцированные клетки гиппокампа, культивируемые на стеклах в тех же условиях. Жизнеспособность культур поддерживалась в СО₂-инкубаторе при температуре 35,5°С, в газовой смеси, содержащей 5% СО₂. Структуру и динамику развития культур оценивали с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Leica, Германия).

Оценка биосовместимости осуществлялась по динамике роста диссоциированной культуры клеток гиппокампа в течение 14 дней развития in vitro и по параметрам морфо-функционального состояния сформировавшихся на матриксах нейронглиальных сетей, которые регистрировали с помощью метода функционального мультиклеточного нейроимиджинга с применением кальций-специфичного флуоресцентного маркера Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB1). Известно, что кратковременное увеличение концентрации Са²+ в цитоплазме клетки является сигнальным процессом, запускающим различные каскады биохимических реакций.

В ходе анализа динамики роста диссоциированной культуры клеток гиппокампа в течение 14 дней развития in vitro с помощью инвертированного микроскопа DM1000 (Lieca, Германия) были выявлены основные закономерности развития, характерные для нормального формирования нейронных сетей первичных диссоциированных культур. В конце первых суток культивирования жизнеспособные клетки прикреплялись в большом количестве на матриксы. Начиная со второго дня культивирования наблюдалось образование на поверхности субстрата сложных сплетений растущих отростков нервных и глиальных клеток, интенсивные процессы роста нейронов и глии, соединение клеток между собой многочисленными отростками (рис. 12), подобно клеткам, которые культивировались на стеклах (Гладков и др., 2011) .

Проведенные исследования функциональной активности нейронов показали появление спонтанных кальциевых осцилляций в диссоциированных культурах гиппокампа, выращенных на матриксах-носителях, на 14-й день культивирования in vitro, что свидетельствовало о формировании полноценной функциональной активности нейронной сети культивируемых клеток на гибридных полимерных матриксах (рис. 14).

Длительность осцилляций составила от 5 до 12 с, частота - 0,9-2,0 (рис. 15) осцилляций в минуту. Наличие в диссоцированных культурах клеток гиппокампа спонтанных изменений содержания внутриклеточного кальция свидетельствовало

Рис. 12. Диссоциированная культура гиппокампа эмбрионов мышей (Е18) на (А) гибридном полимерном матриксе и (Б) стекле на 14 день развития in vitro. Масштаб 50 мкм

Рис. 13. Кальциевый флуоресцентный имиджинг диссоциированной культуры гиппокампа эмбрионов мышей (Е18) на гибридных полимерных матриксах на 14-й день развития in vitro. А - флуоресцентный канал, Б - канал проходящего света, В - совмещенный имиджинг. Масштаб 50 мкм

Рис. 14. Характерный профиль кальциевой активности клеток 2-х первичных культур гиппокампа на 14-й день развития in vitro на гибридных полимерных матриксах. По оси абсцисс - время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл. ед

о нормальном развитии культуры in vitro, соответствующем типичному для данного срока функционального онтогенеза (10-14 DIV) (Митрошина и др., 2011; Широкова и др., 2013).

С использованием лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии были построены 3D-изображения нейрон-глиальной сети, сформировавшейся на гибридных полимерных матриксах (рис. 16). Было доказано, что матриксы обладают

Рис. 15. Длительность и частота Са²⁺-осцилляций нейронов на 14-й день развития in vitro. Контроль - культивирование диссоциированных клеток гиппокампа на стеклах, покрытых полиэтилени- мином; скаффолд - культивирование диссоциированных клеток гиппокампа на гибридных полимерных матриксах

Рис. 16. Трехмерная реконструкция флуоресцентного имиджинга диссоциированной культуры гиппокампа эмбрионов мышей (Е18) на гибридных полимерных матриксах на 14-й день развития in vitro

хорошей адгезивной способностью, сохраняют прикрепившиеся при посадке нервные клетки, стимулируют рост их отростков.

3.