Применение аденозинфосфатов для предотвращения молекулярного старения NADH-дегидрогеназы в митохондриях

М.С. Фролова, Н.Л. Векшин

Нейродегенеративные процессы в мозге приводят, в частности, к паркинсонизму. Старческий паркинсонизм с трудом поддается лечению. Применение различных медикаментов помогает на время снять симптомы, но не более того.

Один из путей лечения, на наш взгляд, мог бы заключаться в восстановлении функции стареющих митохондрий. Ведь старение митохондрий может приводить к дегенерации нейронов. Старые митохондрии - постмитохондрии - характеризуются ухудшением работы дыхательной цепи, снижением продукции АТФ, появлением липофусцина (Белякович, 1990).

В последние годы старческое развитие нейромышечных дегенеративных заболеваний все чаще связывают с нарушениями работы NADH-дегидрогеназного комплекса I в митохондриях (Seo et al., 2004; Varghese et al., 2009) и, как следствие, повышенным окислительным стрессом клеток.

Мы предполагаем, что одним из факторов, вызывающим эти нарушения, является потеря связи между FMN и NADH-дегидрогеназой.

FMN находится в 50-кДа субъединице NADH-дегидрогеназы (именно эта субъединица имеет активный центр для связывания NADH). FMN связан с ферментом нековалентно и поэтому при различных воздействиях легко выпадает. Это может происходить спонтанно с течением времени, при небольшом повышении температуры, под действием следовых количеств (0,001%) детергентов и других вредных факторов (Соколова, Векшин, 2008; Векшин, 2009). В результате электроны от NADH не идут далее по электрон-транспортной цепи, а напрямую восстанавливают молекулярный кислород до супероксида. Перепроизводство супероксид-аниона, способного приводить к перекисному окислению липидов, к повреждению белков и ДНК, вызывает неизбежное старение как самих митохондрий, так и других клеточных органелл.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что предотвратить потерю связи между NADH-дегидрогеназой и молекулой FMN можно с помощью NAD, который стабилизирует собой фермент (Соколова, Векшин, 2008; Векшин, 2009). Такое действие NAD вызвано, во-первых, тем, что он, являясь продуктом окисления NADH, ингибирует реакцию дегидрирования и, во-вторых, находясь в активном центре, механически стабилизирует активный центр, что препятствует вываливанию FMN.

Сокращения: FAD - флавинадениннуклеотиды; FMN-H₂ - восстановленный флавин.

К сожалению, возможное лечение митохондриальных энцефаломиопатий с использованием NAD затруднительно, так как он плохо проникает в клетки и в сами митохондрии. Кроме того, NAD может тормозить работу NADH-дегидрогеназы, алко- гольдегидрогеназы и других NAD-зависимых ферментов.

Своей задачей в этой работе мы поставили протестировать некоторые природные аналоги NAD на предмет стабилизации FMN в NADH-дегидрогеназе, причем, что особенно важно, без подавления ферментативной активности. Для этого был выбран ряд природных веществ с похожей на NAD химической формулой: АТP, АDP, АМP, аденин, аденозин, никотиновая кислота и никотинамид.

Чтобы увеличить спонтанный выход FMN, изолированные митохондрии инкубировались при температуре 37°С в течение двух часов. Для того чтобы такие вещества, как NAD, NADH, аденин и аденозин, лучше проникали в митохондрии, была выбрана гипотоническая среда инкубации, содержащая 100 мМ сахарозы и 10 мМ Tris-фосфат, рН=7,0. В такой среде митохондриальные мембраны становятся более проницаемыми. Кроме того, митохондрии использовались после однократной заморозки, что способствует некоторой пермеабилизации мембран и лучшему проникновению веществ (но не разрушает самих органелл).

Для определения ферментативной активности NADH-дегидрогеназы был выбран фотометрический метод Беляковича с помощью пара-нитротетразолия фиолетового (p-NTV), восстанавливающегося до формазана, который откладывается в матриксе митохондрий в виде микрокристалликов и не влияет на дальнейшую скорость реакции (Белякович, 1990).

Митохондриальную фракцию из печени крыс выделяли в среде, содержащей 20 мМ Tris-HCl и 250 мМ сахарозы (рН=7,7), при температуре 2°С стандартным методом с некоторыми модификациями (Шарова, Векшин, 2004). Сначала центрифугировали исходную общую суспензию на BECKMANJ2-21 при 1000 g в течение 10-15 мин, в результате чего осаждались (и затем отбрасывались) клетки и другие крупные частицы. Супернатант центрифугировали в течение 15 мин при 5000 g, в результате чего осаждались в основном зрелые тяжелые митохондрии, которые затем суспендировали в той же среде (9 мл на 1.5 мл осадка), расфасовывали на льду в пробирки Eppendorf по 1 мл, замораживали и использовали для опытов (после размораживания). В ряде случаев выделение митохондрий производили в среде, содержащей 200 мМ сахарозы, 100 мМ маннит, 10 мМ хепес (рН=7,5), и осуществляли двойную промывку с двукратным центрифугированием при 5000 g.

Ферментативная реакция окисления NADH паранитротетразолием фиолетовым (p-NTV) детектировалась по образованию формазана, откладывающегося внутри митохондрий. В ходе ферментативной реакции окисления NADH молекула p-NTV восстанавливается до формазана, и суспензия митохондрий приобретает из- за него розовую окраску. В этих опытах к суспензии митохондрий из печени крысы добавляли 100 мкМ NADH, 100 мкМ p-NTV и тестируемое вещество (ADP, аденозин и др.) в избытке (до 300 мкМ). Кинетику увеличения оптической плотнос- ти при образовании формазана измеряли в течение 15 минут на спектрофотометре «ПромЭкоЛаб-5400УФ» (Санкт-Петербург) при 540 нм.

Концентрацию митохондриального белка определяли УФ-экспресс-методом (Векшин, 1988). Все фракции выравнивали по содержанию белка с помощью буфера (100 мМ сахарозы и 10 мМ Tris-фосфат, рН=7,0) до конечной концентрации 0,3 мг/мл.

Спектры флавиновой флуоресценции митохондрий записывали на спектрофлу- ориметре SLM-4800 (SLM, Inc., США) в 1-сантиметровой или 0,4-сантиметровой кюветах при 20°С.

Для обнаружения локализации флавина после 2-часовой инкубации при 37°С раствор митохондрий пропускался через 0,2-микронные миллипоровые фильтры и затем проводилось измерение флуоресценции фильтрата (митохондрии оседали на фильтре). Через такие поры проходят помимо флавинов и флавобелков также протомитохондрии (малые зародышевые незрелые митохондрии), но они почти не содержат флавинов (Зинина, Векшин, 2008; Векшин, 2010). В других измерениях, где митохондрии не мешали измерению флавиновой флуоресценции, они не удалялись из раствора. Все измерения проводились по 5-10 раз на митохондриальных фракциях из разных животных, затем находилось среднеарифметическое значение, которое затем нормировалось на 100%.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что процесс выхода FMN из активного центра NADH-дегидрогеназы может ускоряться некоторыми веществами, в частности - следовыми количествами детергентов, а также небольшим длительным нагреванием. Это согласуется с давно известным фактом полной или частичной утраты FMN в ходе препаративных работ по выделению и очистке изолированной NADH-дегидрогеназы (Galante, Hatefi, 1979; Dooijewaard et al., 1978; Almeida et al., 1999; Cremona, Kerney, 1964; Okun et al., 2000). Причем утрата FMN сопровождается падением NADH:убихинон-редуктазной активности, но не NADH:феррицианид- редуктазной. Это связано с тем, что FMN во второй реакции не участвует (Векшин, 2009; Шарова, Векшин, 2004). Не участвует он и в NADH:тетразолий-редуктазной реакции (Векшин, 2009).

В наших экспериментах по стабилизации флавиновых молекул в ферменте мы инкубировали митохондрии в течение 2 часов при 37°С. После этого при 20°С измеряли флавиновую флуоресценцию (к_возб=450 нм, ^_эмисс=525 нм).

При этом интенсивность флавиновой флуоресценции в контрольных пробах при инкубации возрастала в 2-3 раза (в разных опытах, в зависимости от сохранности митохондрий). Нужно отметить, что вклад в общую флавиновую флуоресценцию митохондриальной суспензии дает не только FMN, принадлежащий NADH-дегидрогеназе, но и флавинадениннуклеотиды (FAD), прочно ковалентно связанные с другими митохондриальными дегидрогеназами. Изменение же интенсивности флавиновой флуоресценции обусловлено в основном именно выходом FMN из NADH-дегидрогеназы в раствор (за счет выхода FMN из митохондрий возрастает его коэффициент экстинкции, а значит и флуоресценция). Молекулы FAD митохондриальных флавопротеинов не вносят заметного вклада в изменение флуоресценции, потому что молекулы FAD остаются связанными ковалентно со своими ферментами внутри митохондриальных сфер, рассеивающих падающий на них свет. К тому же, флуоресценция FAD затушена ароматическими аминокислотами и железо-серными кластерами (Векшин, 2009).

Помимо регистрации изменений интенсивности флуоресценции мы измеряли степень поляризации флавиновой флуоресценции, по величине которой можно определить, в каком состоянии находится FMN - связанном или свободном (Векшин, 2009).

Для того чтобы проверить, где именно оказался высвобожденный FMN - в митохондриальном матриксе или внешнем растворе - мы измеряли интенсивность и степень поляризации также в фильтратах, полученных путем фильтрации суспензий митохондрий (до и после 2-часовой инкубации) через 0,2-микронные миллипо- ровые фильтры. Интенсивность флуоресценции в фильтрате увеличивалась после инкубации митохондрий (в сравнении с митохондриями до инкубации) в 4,3 раза. Это составило 94% от общей интенсивности флуоресценции после инкубации. При этом степень поляризации флуоресценции в фильтрате снижалась очень сильно - до 0,06, что соответствует свободному вращению FMN в водной фазе (Векшин, 2009). Полученные данные однозначно говорят о том, что почти весь FMN попадает во внешний раствор, причем в свободном виде. Молекулы FMN, отошедшие в NADH-дегидрогеназе от железо-серных кластеров (которые тушили флуоресценцию FMN) и вышедшие из фермента в матрикс (но не успевшие выйти в наружный раствор), дают в изменение интенсивности небольшой вклад.

Нужно особо подчеркнуть, что в наших опытах изменения флавиновой флуоресценции не связаны с процессами окисления/восстановления флавинов, т.к. двухчасовая инкубация митохондрий в большинстве экспериментов осуществлялась в отсутствие NADH, сукцината и иных восстановителей или окислителей. Только в одном случае - при использовании NADH в ходе инкубации - имели место одновременно два явления: восстановление FMN до нефлуоресцирующего FMN-H₂ и стабилизация FMN в ферменте. Поскольку восстановленный флавин (FMN-H₂) имеет разрыхляющие орбитали и не стабилен (сразу отдает электроны в дыхательную цепь, на убихинон), то он быстро переходит вновь в свою окисленную флуоресцирующую форму. Таким образом, вряд ли редокс-переходы FMN/FMN-H₂ вносят ощутимый вклад в изменения флавиновой флуоресценции.

Мы протестировали ряд веществ с частично похожей на NAD химической формулой: аденин, аденозин, ATP, ADP, AMP, никотиновая кислота, никотинамид, NAD.

Начнем с аналогов адениловой части кофемента: аденин, аденозин, ATP, ADP, AMP.

При добавлении ATP, ADP или AMP в концентрации 300 мМ к суспензии печеночных митохондрий флавиновая флуоресценция изменялась, соответственно, на 44,8%, 49,4% и 41% меньше по сравнению с контролем (рис. 1, табл. 1). При до-

Рис. 1. Влияние аналогов NADH на интенсивность флавиновой флуоресценции в ходе инкубации митохондрий при 37°С. Интенсивность измерена при 20°С

Таблица 1

Влияние NADH и его аналогов (300 мкм) на интенсивность флавиновой флуоресценции (%) в ходе инкубации митохондрий при 37°С

бавлении 300 мкМ AMP к 0,1 мкМ FMN, растворенного в воде (без митохондрий), интенсивность флавиновой флуоресценции не изменялась, т.е. комплексообразование FMN с тестируемыми веществами отсутствовало. Нужно заметить также, что AMP действовал на флавиновую флуоресценцию митохондрий даже в 10-кратно меньшей концентрации - 30 мкМ, причем не хуже, чем 300 мкМ, что говорит о довольно высокой константе связывания этой молекулы с NADH-дегидрогеназой.

Степень поляризации флавиновой флуоресценции при добавлении ATP, ADP и AMP по сравнению с контролем была больше в 2 раза, 1,9 раза и 1,8 раза, соответственно (рис. 2, табл. 2). Это свидетельствует о том, что в присутствии указанных веществ молекулы FMN в основном оставались связанными с молекулами фермента.

Также мы изучали, как влияют указанные вещества на ферментативную реакцию окисления NADH. На рис. 3 показана кинетика NADH-тетразолиевой реакции в течение 15 минут. Видно, что сильных отклонений от хода реакции по сравнению с контролем практически нет. Причем AMP даже ускорял реакцию. Следовательно, можно сделать вывод, что данные вещества (ATP, ADP и AMP) не подавляют фер-

Рис. 2. Влияние аналогов NADH на степень поляризации флавиновой флуоресценции в ходе инкубации митохондрий при 37°С. Поляризация измерена при 20°С

Таблица 2

Влияние NADH и его аналогов (300 мкМ) на степень поляризации флавиновой флуоресценции митохондрий в ходе их инкубации при 37°С

Рис. 3. Действие адениловых нуклеотидов на реакцию восстановления пара-нитратетразолия p-NTV. Температура 20°С

Таблица 3

Скорость ферментативного окисления NADH с помощью p-NTV, измеренная по оптической плотности (D) образующегося формазана в присутствии 300 мкМ тестируемых веществ

ментативную активность NADH-дегидрогеназы (табл. 3). В использованных концентрациях они не конкурируют с NADH за активный центр.

При добавлении аденина или аденозина в концентрации 300 мкМ к суспензии печеночных митохондрий изменения флавиновой флуоресценции и степени поляризации флавинов (см. табл. 1, 2) по сравнению с контролем были мало выражены. И эти вещества не влияли на ферментативную активность NADH-дегидрогеназы (см. табл. 3).

Вторая группа аналогов NADH включает в себя никотиновую часть молекулы. Мы протестировали такие вещества, как NAD, NADH, никотиновую кислоту и никотинамид. Из табл. 1 видно, что NAD и NADH препятствуют выходу молекулы FMN, но не настолько хорошо, как AMP, ADP или ATP.

NAD в большой концентрации (2 мМ) успешно конкурирует с NADH за активный центр. Поэтому он полностью ингибирует процесс образования формазана. А в концентрации 300 мкМ он снижает реакцию лишь на 20% (см. табл. 3).

Ряд исследователей (Гривенникова, Виноградов, 2003; Vinogradov, 1998; Grivennikova, Vinogradov, 2006; Albracht et al., 1997) утверждают, что в NADH- дегидрогеназе есть два центра связывания (рис. 4). Предполагается, что в первом происходит окисление NADH, во втором - восстановление NAD. Такие аналоги NAD, как ATP, ADP и AMP, могут связываться со вторым центром, стабилизируя его и механически не давая молекуле FMN выйти из белка в раствор (первый центр занят молекулой NADH или NAD). Несмотря на свой небольшой, по сравнению с NAD, стерический размер, адениловые нуклеотиды в концентрации 300 мкМ не конкурируют за центр связывания с NADH - не ингибируют NADH-тетразолиевую реакцию (см. табл. 3). Интересно, что в случае с AMP эта реакция даже ускоряется (до 30%), что может говорить об аллостерическом регулировании фермента. В присутствии других аналогов скорость данной реакции не отличается от контроля. Очевидно, что адениловые нуклеотиды взаимодействуют либо со вторым центром, либо, что более вероятно, у них есть свой собственный центр связывания с NADH- дегидрогеназой.

Судя по изменениям интенсивности флавиновой флуоресценции, действие NAD меньше на 23% по сравнению с контролем, что в среднем на 21% меньше, чем у ATP, ADP и AMP. Самая высокая степень поляризации флуоресценции FMN в белке наблюдается в присутствии NAD - на 13% больше, чем в случае с ATP (при концентрациях 300 мкМ).

Нужно отметить, что при измерении интенсивности и степени поляризации флуоресценции флавинов в присутствии NADH необходимо учитывать, что в ис-

Рис. 4. Фрагмент комплекса I дыхательной цепи митохондрий

Показан путь стабилизации NADH-дегидрогеназы с помощью аденозинфосфатов

пользованной концентрации NADH в воде образует димеры, которые, возбуждаясь при 450 нм, флуоресцируют в той же области, при 525 нм, что и FMN (данные не приводятся). При концентрации 300 мкМ димеры NADH дают вклад около 50% в общую интенсивность. Некоторые исследователи ранее ошибочно принимали флуоресценцию димеров NADH за флавиновую флуоресценцию. За вычетом вклада димеров NADH интенсивность флуоресценции FMN в присутствии NADH на 45% больше по сравнению с контролем. Такая же разница с контролем - у ATP, ADP и AMP, в среднем - 45%.

При добавлении никотинамида или никотиновой кислоты в концентрации 300 мкМ к митохондриям наблюдается увеличение флавиновой флуоресценции на 39% и на 33%, соответственно, по сравнению с контролем. При этом степень поляризации флавиновой флуоресценции в случае применения никотинамида и никотиновой кислоты мало отличаются от контроля. Можно сделать вывод, что эти вещества практически не защищают NADH-дегидрогеназу от потери флавина (см. рис. 1, 2). На реакцию окисления NADH они также не влияют (см. табл. 3).

Подводя итоги, можно заключить, что аденозинфосфаты (ATP, ADP и AMP) способны эффективно препятствовать выходу FMN из NADH-дегидрогеназы, причем не хуже, чем NAD и NADH. Они гидрофильны, хорошо проникают в клетки и митохондрии. Как известно, клетки обычно поддерживают соотношение между ATP и ADP постоянным, а содержание AMP может заметно варьировать. Введение избыточных количеств одного из аденозинфосфатов при лечении не вызовет нарушения их внутриклеточного баланса, но может на время акативировать аде- нозинфосфат-зависимые ферментативные реакции. Не случайно АМР и АТР применяются в настоящее время в спортивной медицине (Бубнова, 2009), а также для лечения мышечной дистрофии, хронической коронарной недостаточности, дистрофии миокарда. Поэтому в принципе можно начать их доклинические испытания на предмет лечения энцефаломиопатий.

Кроме того, важно будет провести в дальнейшем для лечения и профилактики митохондриального старения и нейродегенеративных заболеваний исследования по поиску и разработке аналогичных синтетических препаратов.

Литература

Белякович А.Г. Изучение митохондрий и бактерий с помощью соли тетразолия п-НТФ. Пущино: ОНТИ НЦБИ, 1990. 200 с.

Бубнова Т.В. Разрешенные лекарственные средства и БАД. Пенза: Пензенский гос. ун-т им. В.Г. Белинского, 2009. 36 с.

Векшин Н.Л. Спектрофотометрическое определение количества белка в стандартных биологических суспензиях // Биол. науки. 1988. Vol. 4. P. 107-111.

Векшин Н.Л. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино: Фотон век, 2009. 176 с. Векшин Н.Л. Фотометрическое и флуориметрическое изучение протомитохондрий из печени юных и взрослых крыс // Биол. мембраны. 2010. Vol. 27. № 5. P. 424-429.

Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Митохондриальный комплекс I // Успехи биол. химии. 2003. Vol. 43. P 19-58.

Зинина А.Н. Векшин Н.Л. Флуориметрическое сравнение протомитохондрий и митохондрий // Биол. мембраны. 2008. Vol. 25. № 6. P. 480-487.

Соколова И.Б., Векшин Н.Л. Потеря флавина НАДН-дегидрогеназным комплексом митохондрий // Биофизика. 2008. Vol. 53. № 1. P 73-77.

Шарова И.В., Векшин Н.Л. Ротенон-нечувствительное окисление НАДН в митохондриальной суспензии осуществляется НАДН-дегидрогеназой фрагментов дыхательной цепи // Биофизика. 2004. Vol. 49. № 5. P. 814-821.

Albracht S.P.J., Mariette A., DeJong P. Bovine-heart NADH:ubiquinone oxidoreductase is a monomer with 8 Fe-S clusters and 2 FMN groups // Biochim. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1318. P. 92-106.

Almeida T., Durante M., Melo, A.M.P., Videira A. The 24-kDa iron-sulphur subunit of complex I is required for enzyme activity // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 265. P 86-92.

Cremona T., Kerney E.B. Studies on the respiratory chain-linked reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1964. Vol. 230. № 7. P 328-333.

Dooijewaard G., Slater E.C., Van Dijk P.J., De Bruin G.J. Chaotropic resolution of high molecular weight (type I) NADH dehydrogenase, and reassociation of flavin-rich (type II) and flavin-poor subunits // Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 503. P 405-424.

Galante Y.M., Hatefi Y. Purification and molecular and enzymic properties of mitochondrial NADH dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophys. 1979. Vol. 192. P. 559-568.

Grivennikova V.G., VinogradovA.D. Generation of superoxide by mitochondrial Complex I // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1757. P 553-561.

Okun J.G., Zickermann V., ZwickerK., SchaggerH., Brandt U. Binding of detergents and inhibitors to bovine complex I - a novel purification procedure for bovine complex I retaining full ingibitor sensitivity // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1459. P 77-87.

Seo B.B., Nakamaru-Ogiso E., Cruz P., Flotte T.R., Yagi T., Matsuno-Yagi A. Functional expression of the single subunit NADH dehydrogenase in mitochondria in vivo: a potential therapy for complex I deficiencies // Hum. Gene. Ther. 2004. Vol. 15. № 9. P 887-895.

Varghese M., Pandey M., Samanta A., Gangopadhyay P.K., Mohanakumar K.P. Reduced NADH coenzyme Q dehydrogenase activity in platelets of Parkinson’s disease, but not Parkinson plus patients, from an Indian population // J. Neurol. Sci. 2009. Vol. 279. № 1-2. P. 39-42.

Vinogradov A.D. Catalytic properties of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and pseudo-reversible active/inactive enzyme transition // Biochim. Biophys. Acta.1998. Vol. 1364. P 169-185.