Протокол Амплификация полной кодирующей последовательности гена флуоресцентного белка Clavularia

1. Подготовьте реакционную смесь для ПЦР:

39 мкл стерильная вода;

5 мкл 10х буфер для Encyclo;

1 мкл dNTP (10мМ каждый);

1 мкл праймер 5'direct(BamHI) (10 мкМ);

1 мкл праймер 3' reverse (HindIII) (10 мкМ);

1 мкл 50х Encyclo полимераза;

1 мкл суммарная кДНК, разбавленная в 10 раз (раздел

3.4.2.

50 мкл суммарный объём.

2. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки,

добавьте каплю минерального масла в пробирки и поместите их в амплификатор.

3. Осуществите амплификацию, используя следующую программу для ПЦР:

4. По окончании амплификации проведите анализ продуктов ПЦР (4 мкл продукта ПЦР на дорожку) с помощью гель-

электрофореза параллельно с 50 нг маркера длин ДНК. Специфический продукт выглядит как полоса на уровне 800 п.н.

(рис. 3.8).

Рис. 3.8. Результат амплификации фрагмента, содержащего полную кодирующую последовательность гена флуоресцентного белка Clavularia (дорожка 1); М - маркер длин ДНК (1 kb DNA

ladder, Сибэнзим)