Исследование полиморфизмов гена TYMS и полиморфизмов гена ТР53 у больных местно-распространенным раком желудка
Генотипирование полиморфных маркеров гена TYMS, расположенных в 5' (TSER G>C) и гена ТР53: Arg Pro в 72 проводили с по^го^ць^о цепной полимеразной реакции (ПЦР) с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов.
Термостабильная ДНК_полимераза Taq получена от НПО «Биотех» (Москва), протеиназа К — фирмы «Merck» (Германия). Синтез использованных в работе олигонуклеотидных праймеров выполнен НПО «Синтол» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной замороженной крови пациентов посредством инкубации с протеиназой К, с последующей экстракцией фенолом-хлороформом, и высаживали 96% этанолом. Полученный осадок высушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл буфера ТЕ.ПЦР проводили на термоциклере «Терцик» ДНК -технологии, в 25 мкл среды, содержащей 67 мМ Трис_НС1, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат магния, 2 мМ хлорид магния, 0,01% раствор твин-20, 10% раствор диметил-сульфоксид, 0,2 мМ каждого dNTP, по 25 нг праймеров, указанных в таблице 1, 20—50 нг геномной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проводили по программе: 94°С/30с; 55-60°С/30 с, 72 °С/30 с. в течение 35 циклов. Последовательности праймеров, температура их отжига и длины полученных в результате ПЦР фрагментов, приведена в таблице 4. Продукты ПЦР разделяли в ПААГс последующей окраской нитратом серебра.
Таблица 4. Праймеры для исследуемых полиморфизмов, режимы их отжига и длины полученных фрагментов
| полиморфизм | Последовательность праймеров | Условия ПЦР | Размер продукта п.н. | |
| ^отж. | MgCb | |||
| TYMS TSER, G>C | F: gcg gaa ggg gtc ctg cca R: tcc gagccg gcc aca ggc at | 60оС | 3,0 | 107-135 |
| TYMS del 6 | F: caa atc tga ggg agc tga gt R: cag ata agt ggc agt aca ga | 60оС | 3,0 | 148 |
| TP53 Arg>Pro | F: ttg ccg tcc caa gca atg gat ga R: tct ggg aag gga cag aag atg ac | 55оС | 3,0 | 199 |
| TP53 Ins 16 | F: ctg aaa aca acg ttc tgg ta R: aag ggg gac tgt aga tgg gtg | 57оС | 3,0 | 134 |
Полиморфные аллели гена TYMS (TSER и del6) определяли, анализируя длины полученных фрагментов в ПААГ, после окрашивания нитратом серебра. Аллели полиморфного маркера гена TYMS, в 5' (TSER G>C) определяли, обрабатывая полученный продукт ПЦР, фрагмент ДНК длиной от 107 до 135 пар нуклеотидов рестриктазой HaeIII (фирма «Сибэнзим»).
У носителей аллеля G в результате рестрикции появлялся фрагмент на 66 пар нуклеотидов, а аллель С, остается нерасщепленным (рисунок 6).
Рисунок 6. Исследование полиморфизмов гена TYMS, расположенных в 5' (R2/R3 и G>C) и 3' (Del 6) нетранслируемой области
Примечание: 1-7 - продукты ПЦР, полученные при исследовании пациентов; внизу рисунка подписаны генотипы, полученные в результате исследования; М- маркер молекулярного веса
Полиморфные аллели гена TP53 (ins 16) определяли, анализируя длины полученных фрагментов в ПААГ, после окрашивания нитратом серебра. Аллели полиморфного маркера Arg72Pro гена TP53 определяли, обрабатывая амплифицированный фрагмент ДНК длиной 199 п.н. рестриктазой Bsh1236I. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Arg, расщепляется этой рестриктазой, образуя продукты размером 110 и 89 п.н., тогда как фрагмент ДНК, содержащий аллель Pro, остается нерасщепленным (рисунок 7).
Рисунок 7. Исследование полиморфизмов гена ТР53: Arg > Pro в 72 кодоне в 4 экзоне и инсерция 16 нуклеотидов в 3 интроне
Примечание: 1-7 - продукты ПЦР, полученные при исследовании пациентов, внизу рисунка подписаны генотипы, полученные в результате исследования; М- маркер молекулярного веса. О - отрицательный контроль ПЦР
2.8.
Еще по теме Исследование полиморфизмов гена TYMS и полиморфизмов гена ТР53 у больных местно-распространенным раком желудка:
- Использование многомерного разведочного анализа для определения прогностической значимости клинико-морфологических факторов и полиморфизмов гена TYMS
- Непосредственные результаты хирургического лечения больных местно-распространенным раком желудка
- Отдаленные результаты хирургического лечения больных местно-распространенным раком желудка
- Объем оперативного вмешательства и отдаленные результаты лечения больных местно-распространенным раком желудка
- Анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов TYMS и ТР53 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли и с рецидивированием рака желудка
- Клинико-морфологические характеристики опухоли и отдаленные результаты лечения больных местно-распространенным раком желудка
- ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ВЗАИМОСВЯЗИ КЛИНИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОПУХОЛИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНО-РАСПРОСТРАНЕННОГО РАКА ЖЕЛУДКА С ПОЛИМОРФИЗМАМИ ГЕНОВ TYMS И ТР53
- Амплификация полной кодирующей последовательности целевого гена. Клонирование и экспрессия гена флуоресцентного белка в бактериальной системе экспрессии (задача 4)
- 3.4.1. Изменения частоты факторов у больных раком желудка и толстой кишки без учета распространенности процесса.
- 3.1. Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа)
- Изменения частоты факторов у больных раком желудка и толстой кишки при I-II стадии распространенности процесса.
- Изменения частоты факторов у больных раком желудка и толстой кишки при III-IV стадии распространенности процесса.