Амплификация дц-кДНК

11. Для каждого образца первой цепи кДНК приготовьте

Внимание! Если первая хранилась перед этим на -20°C, ее надо разморозить и прогреть 1 мин при 65°С для дезагрегации ДНК.

12. Аккуратно перемешайте компоненты реакционной смеси, сбросьте капли со стенок пробирки на настольной центрифуге.

13. Распределите по 25 мкл реакционной смеси в четыре пробирки для ПЦР.

14. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки, добавьте каплю минерального масла в каждую ПЦР-пробирку. Закройте пробирки, поместите их в амплификатор.

15. Осуществите ПЦР амплификацию кДНК, используя следующую программу:

16.

17. После 18 циклов достаньте из амплификатора еще одну пробирку, остальные подвергните еще трем циклам ПЦР.

18. После 24 циклов достаньте из амплификатора еще одну пробирку, а последнюю пробирку подвергните еще трем циклам

ПЦР.

19. Проведите анализ продуктов ПЦР с помощью гель- электрофореза (1,2 % агароза, TAE буфер с добавлением бромистого этидия, 4 мкл продукта ПЦР на дорожку) параллельно с 50 нг маркера длин ДНК (1 kb DNA ladder).

20. Сравните результат гель-электрофореза с приведенным на рис. 3.2. Определите оптимальное количество циклов ПЦР для каждого экспериментального образца исходя из следующих рекомендаций:

- отсутствие изменений в концентрации продукта ПЦР при добавлении циклов указывает на то, что реакция вышла на плато. Оптимальное для амплификации образца количество циклов должно быть на 1-2 цикла меньше необходимого для выхода реакции на плато;

- при оптимальном количестве циклов ПЦР, продукт реакции при визуализации гель-электрофорезом обычно имеет следующие характеристики:

а) шмер умеренной интенсивности в области 0,25-3 т.п.н. с максимумом плотности 0.5-2 т.п.н. Интенсивность шмера должна примерно соответствовать той, которую имеют образцы кДНК, показанные дорожке 2 на рис. 3.2 (сравнение относительно интенсивности маркера).

Внимание! Если интенсивность шмера не нарастает с увеличением циклов ПЦР и смещена к лунке (например, как на дорожке 4 рис. 3.2), значит, образец кДНК подвергся избыточной амплификации.

Если интенсивность шмера существенно ниже (например, как на дорожке 1 рис. 3.2), значит, количество циклов ПЦР было недостаточно для амплификации этого образца.

б) наличие нескольких ярких полос, соответствующих высокопредставленным транскриптам. «Размывание» характеристических полос свидетельствует об избыточном количестве циклов ПЦР.

21. Сохраните продукт ПЦР с оптимальным числом циклов. Внимание! Избыточное число циклов ПЦР приводит к

возникновению неспецифических продуктов, что крайне нежелательно для выполнения дальнейших процедур.

Продукт ПЦР можно хранить при -20C в течение, по меньшей мере, шести месяцев.

Рис. 3.2. Амплифицированная кДНК кораллового полипа Clavularia. Количество циклов ПЦР, которому подвергся образец кДНК указано наверху. В данном случае оптимальному числу циклов ПЦР подвергся образец, нанесенный на дорожке 2

3.3.