раунд амплификации

Внимание! В третьем раунде амплификации используют праймеры WEP dir 3 и Step-out mix 3.

17. Разведите аликвоту амплифицированной кДНК, полученной на предыдущем этапе (п.16, раздел 3.4.2), в 10 раз стерильной водой.

18. Подготовьте реакционную смесь для ПЦР:

0,5 мкМ / Na21 - 5 мкМ);

1 мкл 50х Encyclo полимераза;

2 мкл ДНК после II раунда, разбавленная в 10 раз;

50 мкл суммарный объём.

Внимание! Реакционную смесь с учетом контрольных реакций можно приготовить так, как описано в Приложении 1.

19. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки, добавьте каплю минерального масла в пробирки и поместите их в амплификатор.

20. Осуществите амплификацию, используя следующую программу для ПЦР:

21. По окончании амплификации проведите анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза (4 мкл продукта ПЦР на дорожку) параллельно с 50 нг маркера длин ДНК.

22. Если по данным электрофореза продукт ПЦР имеет низкую концентрацию, верните пробирку в амплификатор и добавьте 2-4 цикла ПЦР.

23. Проведите сравнительный анализ на гель-электрофорезе продуктов ПЦР после первого, второго (и третьего, если есть) раундов амплификации для оценки степени обогащения специфическим продуктом и изменением его длины в ходе nested/step-out ПЦР (рис. 3.7).

Внимание! При проведении реального исследования, фрагмент кДНК, полученный в результате 3'-RACE, клонируют и секвенируют. Анализ полученной нуклеотидной последовательности позволяет выбрать ген-специфические праймеры для амплификации 5'-концевой последовательности (5'- RACE). При проведении 5'-RACE осуществляют один или несколько раундов амплификации с использованием суммарной амплифицированной кДНК в качестве матрицы для первой ПЦР, ген-специфических праймеров, направленных в сторону 5'-конца гена, и адаптерных смесей Step-out mix 1-3. Конечным результатом процедуры 5'-RACE является получение гомогенной ДНК, соответствующей 5'-концевому фрагменту целевого транскрипта. ДНК клонируют и секвенируют. Анализ перекрывающихся последовательностей позволяет воссоздать полную кодирующую последовательность целевого гена и синтезировать праймеры для ее амплификации. Для экономии времени эти процедуры исключены из задач практикума.

Рис. 3.6. Результат третьего раунда амплификации 3'-концевого фрагмента

кДНК гена флуоресцентного белка Clavularia: дорожка 1 - продукт ПЦР после 16 циклов; М - маркер длин ДНК (1 kb

DNA ladder, Сибэнзим)

Рис. 3.7. Результат первого, второго и третьего раундов амплификации 3'-концевого фрагмента кДНК гена

флуоресцентного белка Clavularia (дорожки 2, 3, 4 соответственно); дорожка 1 - исходная кДНК; М - маркер длин

ДНК (1 kb DNA ladder, Сибэнзим)

3.1.