Направленное клонирование фрагмента ДНК

Внимание! Некоторые стадии протокола могут быть

выполнены одновременно (например, см. пп. 6-9). Внимательно прочитайте протокол перед началом работы.

5. Продукт ПЦР очистите на колонке для очистки ДНК согласно инструкции производителя колонок.

6. Подготовьте реакционную смесь для реакции рестрикции ДНК-вставки (ДНК со стадии 5). Для этого смешайте реагенты в указанном порядке:

11 мкл стерильная вода;

25 мкл ДНК вставки (после элюции);

5 мкл 10х буфер W (Сибэнзим);

5 мкл 10х БСА (1 мг/мл);

2 мкл эндонуклеаза рестрикции BamHI (Сибэнзим);

2 мкл эндонуклеаза рестрикции HindIII (Сибэнзим);

50 мкл суммарный объем.

7. Инкубируйте реакционную смесь 1,5-2,0 ч при 37°С в настольном термостате. По окончании инкубации очистите ДНК на колонке, воспользовавшись инструкцией производителя. Элюируйте ДНК 25 мкл элюирующего буфера.

8. Подготовьте реакционную смесь для реакции рестрикции вектора pQE-30. Для этого смешайте реагенты в указанном порядке:

21 мкл стерильная вода;

15 мкл плазмида pQE-30 (100 нг/мкл);

5 мкл 10х буфер W (Сибэнзим);

5 мкл 10х БСА (1 мг/мл);

2 мкл Эндонуклеаза рестрикции BamHI (Сибэнзим);

2 мкл Эндонуклеаза рестрикции HindIII (Сибэнзим);

50 мкл суммарный объем.

9. Инкубируйте смесь 1 ч при 37°С. 1,5-2,0 ч при 37°С в настольном термостате.

10. По окончании инкубации проанализируйте 2 мкл реакции со стадии 9 электрофорезом, рядом следует нанести 1 мкл нерезанной плазмидной ДНК pQE-30. Убедитесь, что продукт рестрикции (линеаризованный вектор) выглядит как полоса, которая отличается по электрофоретической подвижности от нескольких полос нерезанной плазмиды.

11. Разделите линеаризованную плазмидную ДНК от нерезанной плазмиды на 0,8-1,0% препаративном агарозном геле. Вырежьте линеаризованный вектор из агарозы скальпелем под длинноволновым (312 или 365 нм) ультрафиолетом, взвесьте полученный фрагмент агарозы и очистите целевой вектор с помощью колонок для очистки ДНК, следуя инструкциям по выделению ДНК из агарозного геля. Альтернативно продукт рестрикции плазмидной ДНК можно очистить без разделения продуктов рестрикции на геле, использовав колонку для очистки

ДНК.

Внимание! Очистка вектора через гель позволяет существенно снизить фон, появляющийся от присутствия недорезанной рестриктазами плазмиды.

12. Оцените концентрацию ДНК вектора и вставки (по 2 мкл) с

помощью электрофореза, для этого нанесите параллельно с опытными образцами 50 нг маркера длин ДНК (1 kb DNA ladder).