Протокол

1. Изолируйте 2-3 выбранных клона петлей или стерильным наконечником для пипетки и перенесите в отдельные пробирки с жидкой средой LB (8-10 мл), содержащей ампициллин (100 мкг/мл).

2. Нарастите биомассу в течение ночи на качалке (установить максимально большие обороты) при 37°С.

Внимание! Как правило, для наработки флуоресцентного белка в E. coli добавление индуктора не требуется. Поэтому, в данном случае протокол производства биомассы упрощен.

3. Осадите биомассу центрифугированием при 3000 об/мин. Эту биомассу можно проанализировать на наличие флуоресценции, сравнив свечение осадков в контрольной и опытной пробирке.

4. Осуществите одностадийную очистку рекомбинантного белка с помощью любой колонки для металлаффинной хроматографии белков, содержащих 6HisTag по протоколу производителя. Для элюции лучше использовать 50мМ раствор ЕДТА, поскольку аналитический препарат не предназначен для дальнейшего изучения. При элюции минимизируйте объем элюционного буфера для увеличения концентрации белка. После элюции можно провести дополнительное центрифугирование 1 мин при 1000 об/мин. для минимизации потерь белкового препарата.

Внимание! В зависимости от имеющейся в распоряжении инструментальной базы белковый препарат можно проанализировать следующими методами:

- снять спектр поглощения и флуоресценции на спектрофлуориметре;

- при отсутствии флуориметра визуально анализировать флуоресценцию белкового препарата под ультрафиолетом;

- разделить методом СДС-ПААГ (полиакриламидный гель).

При этом флуоресцентный белок, нанесенный в гель в неденатурирующих условиях, сохраняет флуоресценцию и окраску в процессе разделения.