Протокол I раунд амплификации
Внимание! В первом раунде амплификации используют праймеры NGH dir 1 и Step-out mix 1.
1. Разведите аликвоту амплифицированной кДНК, полученной на предыдущем этапе (раздел 3.3.2.
п. 21 протокола), в 10 раз стерильной водой. Для этого прогрейте образец кДНК, хранившийся замороженным, 2 мин при 70°С для дезагрегации ДНК, отберите аликвоту 4 мкл и поместите ее в чистую пробирку. Добавьте 36 мкл стерильной воды. Раствор перемешайте встряхиванием, сбросьте капли со стенок пробирка центрифугированием.2. Подготовьте реакционную смесь для амплификации, смешав компоненты реакции в следующем порядке:
| 39 мкл | стерильная вода; |
| 5 мкл | 10х буфер для Encyclo полимеразы; |
| 1 мкл | dNTP (10мМ каждый); |
| 1 мкл | праймер NGH dir 1 (10 мкМ); |
| 1 мкл | смесь праймеров Step-out mix 1; |
| 1 мкл | 50х Encyclo полимераза; |
| 48 мкл | суммарный объём. |
3. Разделите реакционную смесь на две пробирки (по 24 мкл).
Одну пометьте как экспериментальную, вторую - как контрольную.
4. Добавьте в “экспериментальную пробирку” 1 мкл разбавленной в 10 раз кДНК. Добавьте в “контрольную пробирку” 1 мкл стерильной воды для ПЦР. После отбора аликвоты разведенную кДНК заморозьте; она потребуется при проведении следующей задачи (раздел 3.5.2, п. 1).
Внимание! Контрольная амплификация без кДНК матрицы позволяет оценить уровень контаминации реактивов посторонней ДНК и избежать в дальнейшем клонирования неспецифических продуктов.
При постановке ПЦР, как правило, рекомендуется также постановка двух дополнительных контрольных реакций: одна - с добавлением одного ген-специфического праймера, другая - с добавлением одного адаптерного праймера.
Эти контрольные реакции позволяют отличить специфический продукт от продуктов фоновой амплификации с одного из праймеров. Описание приготовления реакционных смесей для ПЦР с постановкой всех контрольных реакций приведено в Приложении 1. Однако в рамках практикума постановка всех контрольных реакций необязательна.5. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки, добавьте каплю минерального масла в каждую пробирку. Закройте пробирки, поместите их в амплификатор.
6. Осуществите амплификацию, используя следующую программу для ПЦР:
| Стадия инкубации | Количество циклов | Температура, °C | Время |
| Предварительная денатурация | 1 | 95 | 1 мин |
| Основные циклы ПЦР | 24-26 | 95 | 15 с |
| 604 | 20 с | ||
| 72 | 1 мин |
4 Температура соответствует температуре отжига ген-специфического праймера. Для приблизительного подсчета температуры отжига праймера можно воспользоваться формулой T=4(G+C)+2(A+T)+5.
7. По окончании амплификации проведите анализ продуктов ПЦР (4 мкл продукта ПЦР на дорожку) с помощью гель- электрофореза параллельно с 50 нг маркера длин ДНК. Длина специфического фрагмента должна быть около 850 п.н., в пробирке с отрицательным контролем продукт ПЦР должен отсутствовать (рис. 3.4, а). В некоторых случаях (загрязнение посторонней ДНК
матрицей, неоптимальные условия ПЦР) продукт ПЦР может быть неразличим на фоне неспецифичного продукта (рис. 3.4, б). Тем не
менее, даже такой ПЦР-продукт может быть использован для следующих раундов амплификации.
8. Если по данным электрофореза в «экспериментальной пробирке» продукты ПЦР имеют низкую концентрацию, верните
пробирки в амплификатор и добавьте 2-4 цикла ПЦР. При полном отсутствии продуктов реакции добавьте 6 циклов ПЦР.
9. Пробирку с продуктом ПЦР промаркируйте несмываемым
маркером и сохраните на -20°С.
Рис. 3.4. Результат первого раунда амплификации 3'-концевого фрагмента кДНК гена флуоресцентного белка Clavularia: а - результат аккуратной постановки реакции; б - целевой фрагмент, неразличимый на фоне неспецифических продуктов ПЦР; дорожка 1 - Продукт ПЦР после 32 циклов; дорожка 2 - отрицательный контроль; М - маркер длин ДНК (1 kb DNA ladder, Сибэнзим)
I
Еще по теме Протокол I раунд амплификации:
- Состояние здоровья населения и системы здравоохранения Республики Казахстан
- Протокол I раунд амплификации