раунд амплификации
Внимание! Во втором раунде амплификации используют праймеры NFP dir 2 и Step-out mix 2. Процедуры второго раунда полностью повторяют процедуры первого, но используются другие праймеры.
Это приводит к изменению условий ПЦР.10. Разведите аликвоту амплифицированной кДНК, полученной на предыдущем этапе (см. п. 9), в 10 раз стерильной водой (см.
п. 1).
11. Подготовьте реакционную смесь для ПЦР:
| 39 мкл | стерильная вода; |
| 5 мкл | 10х буфер для Encyclo; |
| 1 мкл | dNTP (10мМ каждый); |
| 1 мкл | праймер NFP dir 2 (10 мкМ); |
| 1 мкл | смесь праймеров Step-out mix 2 (Т7 |
0,5 мкМ / Na21 - 5 мкМ);
1 мкл 50х Encyclo полимераза;
2 мкл кДНК, разбавленная в 10 раз;
50 мкл суммарный объём.
Внимание! Реакционную смесь с учетом контрольных реакций можно приготовить так, как описано в Приложении 1.
12. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки, добавьте каплю минерального масла в пробирки и поместите их в амплификатор.
13. Осуществите амплификацию, используя следующую программу для ПЦР:
| Стадия инкубации | Количество циклов | Температура, °C | Время |
| Предварительная денатурация | 1 | 95 | 1 мин |
| Циклы ПЦР | 14-17 | 95 | 15 с |
| 60 | 20 с | ||
| 72 | 1 мин |
14. По окончании амплификации проведите анализ продуктов ПЦР (4 мкл продукта ПЦР на дорожку) с помощью гель- электрофореза параллельно с 50 нг маркера длин ДНК.
Специфический продукт выглядит как полоса на уровне 550 п.н. Возможно наличие продуктов фоновой амплификации (дополнительные полосы на электрофореграмме или шмер, рис. 3.5). В случае, если продукт ПЦР, полученный во втором раунде амплификации, не гомогенен, переходите к третьему раунду амплификации. Если продукт ПЦР выглядит гомогенным, нет необходимости проводить III раунд амплификации, переходите к выполнению п. 23.15. Если по данным электрофореза продукт ПЦР имеет низкую концентрацию, верните пробирку в амплификатор и добавьте 2-4
цикла ПЦР.
16. Пробирку с продуктом ПЦР промаркируйте несмываемым маркером и сохраните на -20°С.
Рис. 3.5. Результат второго раунда амплификации 3'-концевого фрагмента кДНК гена флуоресцентного белка Clavularia: дорожка 1 - продукт ПЦР после 17 циклов; М - маркер длин ДНК (1 kb DNA ladder, Сибэнзим)
II
Еще по теме раунд амплификации:
- 1.4. Определение полного размера CpG-островка гена /ЗА-адаптина.
- Состояние здоровья населения и системы здравоохранения Республики Казахстан
- Введение
- Nested ПЦР и Step-out ПЦР
- Дизайн вырожденных праймеров
- Подбор структуры праймеров и амплифицикация ДНК для последующего клонирования
- Необходимые реактивы и оборудование:
- Протокол I раунд амплификации
- раунд амплификации
- раунд амплификации