Амплификация 3'-концевых фрагментов кДНК, 3'- RACE

Большая часть методов 3'-RACE основана на использовании известной (адаптерной) последовательности олиго^Т)-праймера, находящейся на 5'-конце первой цепи кДНК. Эта последовательность вводится в структуру кДНК, как описано в разделе 2.3.

Для амплификации 3'-концевого фрагмента целевой кДНК осуществляют амплификацию с адаптерного праймера и встречного праймера, отжигающегося на известную последовательность целевого гена. Однако в ходе такой ПЦР, кроме амплификации целевого фрагмента, происходит эффективная наработка неспецифических продуктов, например, с одного адаптерного праймера. В различных технологиях RACE используют различные подходы для подавления неспецифической амплификации и селекции целевого продукта.

В рамках настоящего пособия предлагается технология Step-out RACE (Matz et al., 1999), в которой подавление нежелательной амплификации с адаптерного праймера достигается за счет использования эффекта селективной супрессии ПЦР [1].

Эффект селективной супрессии ПЦР (ССП-эффект, рис. 2.2) заключается в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми повторами (ИКП), в ПЦР с праймером, отжигающимся на внешнюю часть ИКП, при условии, что длина праймера значительно меньше длины ИКП. Этот факт объясняется следующим образом. На каждом цикле ПЦР после денатурации в процессе охлаждения образца внутримолекулярная гибридизация ИКП (самоотжиг) происходит раньше, чем отжиг праймера, так как температура самоотжига ИКП выше температуры отжига праймера. Только небольшая часть молекул ДНК достигает температуры отжига праймера без формирования вторичной структуры, закрывающей сайт посадки праймера. Те молекулы, на которые праймер все-таки отжегся, после синтеза второй цепи ДНК восстанавливают исходную структуру, что обеспечивает сохранение ингибиторного эффекта на дальнейших циклах ПЦР.

Внимание! Степень ингибирования амплификации зависит от многих параметров, из которых основными являются следующие:

1.

используемого для амплификации. Оптимальным представляется

использование ИКП длиной 40-50 нуклеотидов и повышенным содержанием GC-пар во внутренней (супрессионной) части ИКП и ПЦР-праймера, соответствующего внешней половине ИКП (длиной 20-25 нуклеотидов.).

2. Длина молекулы ДНК, несущей ИКП. Чем длиннее молекула, тем меньше вероятность внутримолекулярной гибридизации ИКП. Таким образом, ССП-эффект не ингибирует (или слабо ингибирует) амплификацию очень длинных молекул ДНК (пороговая длина зависит от конкретных условий, обычно она составляет 6-8 т.п.о.).

3. Концентрация праймера в ПЦР. ССП-эффект зависит от конкуренции между внутримолекулярной гибридизацией ИКП и отжигом праймера, используемого для ПЦР. Поэтому ССП происходит более эффективно при низких концентрациях праймера.

Использование ССП-эффекта позволяет подавить

амплификацию неспецифичных последовательностей с одного адаптерного праймера в ходе RACE (рис. 2.3). Для введения ИКП в молекулы кДНК в реакционную смесь добавляют смесь Step-Out- mix, содержащую длинный супрессионный адаптер - олигонуклеотид, способный отжигаться на адаптерную последовательность, фланкирующую молекулы кДНК (последовательность Ml-праймера), и короткий праймер, соответствующий внешней части супрессионного адаптера.

Концентрация праймеров в смесях Step-out primer mix подобрана таким образом, что длинный праймер участвует только в первых циклах ПЦР, создавая на концах молекул кДНК последовательность, комплементарную его внешней части. В результате формируется сайт для отжига короткого праймера. На первых циклах длинный адаптер полностью расходуется и перестает участвовать в реакции; дальнейшая амплификация происходит с короткого праймера. Кроме смеси Step-out primer mix в реакционную смесь добавляют ген-специфичный праймер, обеспечивающий амплификацию целевой последовательности.

Таким образом, в присутствии Step-out primer mix и ген­специфичного праймера происходит селективная амплификация только тех молекул, которые содержат сайт для отжига этого специфичного (или вырожденного) праймера, т.е., в данном случае, 3'-концевые последовательности целевого гена. Амплификация молекул, не содержащих сайта для отжига специфичного праймера, подавляется благодаря ССП-эффекту.

Рис. 2.2. Эффект супрессии ПЦР. ИКП - инвертированные

концевые повторы

2.4.1.