Культивирование простейших кишечника

в ряде случаев позволяет значительно увеличить частоту обнаружения кишечных и ротовых трихомонад, хиломастиксов, энтеромонад, балантидиев, по сравнению с обнаружением их методами протозооско- пии.

Для культивирования простейших кишечника предложено особенно много сред. Наиболее простыми и вместе с тем дающими удовлетворительные результаты являются следующие:

Среда Павловой (см. стр. 71), применяется для культивирования дизентерийных амеб. Пригодна также для кишечных и ротовых трихомонад, первичного выделения культур балантидиев, хиломастиксов, энтеромонад.

Среда с печеночным экстрактом. Предложена А. Ф. Тумкой в 1963 г. Состав среды: физиологического раствора— 1000 мл, мясо-пептонного бульона — 20 мл, печеночного экстракта — 20 мл, глюкозы — 2,5 г, двузамещенного фосфорнокислого натрия и однозамещенного фосфорнокислого калия — по 0,45 г. После стерилизации в автоклаве в колбах добавляется нативная сыворотка крупного рогатого скота (1 часть на 7—9 частей смеси) и среда разливается в стерильные пробирки по

8— 10 мл. Ha указанной среде обилыю растут дизентерийные амебы.

Среда Рейса. Мясо-пептонный бульон (1 часть) смешивают с физиологическим раствором (4 части) в колбах, стерилизуют в автоклаве, добавляют стерильно лошадиную или бычью сыворотку в количестве 1 часть на 10—15 частей среды и разливают в пробирки по 8—10 мл. Применяется для культивирования балантидиев.

Простая сывороточная среда. Смесь из 9 частей стерильного физиологического раствора и 1 части нормальной лошадиной сыворотки, разлитая в пробирки по 8—10 мл. Применяется в тех же случаях и почти с такими же результатами, как и среда Павловой.

Среда Джона. Составные части (в г): хлористого натрия— 8,0, двууглекислого натрия (NaHCO3)—0,4, хлористого кальция — 0,2, хлористого калия — 0,2, хлористого магния — 0,1, порошка сердечной мышцы — 0,1, дистиллированной воды 1 л.

После растворения ингредиентов среду стерилизуют текучим паром в течение 1 ч, фильтруют через фильтровальную бумагу, добавляют 0,1 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (NaH2PO4). Смесь разливают в пробирки по 8 мл, повторно стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением в 1 атм, охлаждают. Перед употреблением добавляют по 1 мл лошадиной сыворотки и 1 петле рисового крахмала в каждую пробирку. Среда пригодна для культивирования амеб, балантидиев и трихомонад.

Среда Баламута. Приготовляется следующим образом: 2 желтка свежих куриных яиц, сваренных вкрутую (кипячение 15 мин), растирают в 125 мл физиологического раствора. Смесь кипятят 10 мин и после охлаждения доливают дистиллированной водой до первоначального объема. Затем фильтруют через фильтровальную бумагу и добавляют к фильтратуфизиологиче- ский раствор до прежнего объема. Автоклавируют при 1,5 атм в течение 15 мин, добавляют 125 мл фосфатного буфера (pH 7,5). После этого автоклавируют повторно. Готовую среду сохраняют в холодильнике. Перед употреблением ее разливают в пробирки по 5 мл и добавляют в каждую рисовый крахмал.

B улучшенном варианте автор рекомендует добавить к готовой среде 5% печеночный экстракт (1 часть на 9 частей среды). После этого среду фильтруют, стерилизуют в автоклаве. Сохраняют и используют готовую среду так же, как и в первом варианте.

Приготовление буферной смеси. 4,3 объемных части IN K2HPO4 (17,42 г на 100 мл дистиллированной воды) смешивают с 0,7 объемными частями IN KH2PO4 (13,61 г на 100 мл воды), разводят в 15 раз дистиллированной водой.

Для приготовления печеночного экстракта 5 г порошка сушеной печени кипятят в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и стерилизуют в автоклаве.

C p e д a C и м и ч a. B отличие от предыдущих является двухфазной. Плотная часть среды состоит из сыворотки крупного рогатого скота (95%) и 2% мясо-пептонного бульона с глюкозой (5%), которые коагулируются при 80° в скошенном положении. Жидкой фазой является физиологический раствор, который наливают после коагуляции плотной части на 1 см выше верхнего края скоса. B процессе длительного культивирования жидкую часть среды через 36 ч после первичного посева удаляют, отсасывая при помощи пастеровской пипетки, и заменяют свежей средой. B дальнейшем жидкую часть заменяют через каждые 12 ч. Ha этой среде хорошо растут и сохраняются дизентерийные амебы и все жгутиконосцы кишечника, за исключением лямблий.

Для получения первичных культур простейших кишечника в пробирки со средой необходимо вносить значительное количество засеваемого материала: оформленного кала — комочек величиной с горошину, жидкого — несколько капель. Засевать нужно одновременно несколько пробирок (5—6). Перед посевом пробирки со средами подогревают до 37° и в каждую добавляется 1—2 петли мелкого стерильного рисового крахмала. Стерилизация крахмала производится сухим жаром при 90° по 1 ч 4 дня подряд или при 160° 40 мин. B последнем случае крахмал нередко подгорает (буреет) и становится непригодным для применения. Для стерилизации крахмал рассыпают по пробиркам не более 5—10 г, пробирки закрывают ватными пробками.

B большинстве случаев при посевах фекалий на питательных средах обильно вырастают грибы Blastocystisi подавляющие рост простейших, особенно амеб. Добавление рисового крахмала лишь отчасти тормозит рост этих грибов. Для полной очистки от них культур рекомендуется добавлять к средам в первые дни после посева акрифлавинвконцентрации 1 :50 000. Хорошие результаты дает обработка загрязненных бластоцистами культур дизентерийной амебы дистиллированной водой. Для этого осадок из трех засеянных пробирок 48-часовой инкубации в количестве около 1,3 мл смешивают в пробирке с 12 мл воды. Пробирку оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Проверка результатов первичных посевов и первые пересевы при длительном культивировании кишечных простейших производятся через каждые 24 ч. Впоследствии, когда прекращается рост бластоцистов и стабилизируется размножение бактерий, пересевы могут производиться через более длительные сроки — 48, 72 и даже 120 ч. Пересевы производят при помощи пастеровской пипетки. Co дна засеянной пробирки набирают осадок с простейшими и вносят его в новую пробирку в количестве 3—5 капель. Одновременно каплю содержимого пипетки наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом по обычной методике на наличие простейших в культуре.

Ha всех перечисленных средах, как и на других, предложенных до сих пор, кишечные простейшие растут только совместно с сопутствующей микрофлорой. При добавлении к этим средам антибиотиков, обладающих выраженным бактериостатическим действием, но не действующих на простейших, последние быстро погибают после исчезновения бактерий. Лишь сравнительно недавно получены были среды, на которых удалось выращивать безбактериальные (аксенические) культуры дизентерийной амебы (Diamond, 1961) и кишечной трихомонады (Ю. X. Tepac и X. Я. Томпель, 1968). Первая из них весьма сложна и состав ее поэтому здесь не приводится. Основным компонентом второй среды служит асцитная жидкость.