КИШЕЧНАЯ КОКЦИДИЯ — ISOSPORA BELLl

B фекалиях человека обнаруживаются только ооцисты кок- цидий, формирующиеся в результате полового процесса. Сам половой процесс, как и предшествующий ему бесполый — шизогония, протекает внутриклеточно в эпителии тонкой кишки.

Клинические проявления заболевания обычно имеют место только в период шизогонии и гамогонии. К началу периода выделения ооцист они проходят. Поэтому оописты в патологическом стуле обнаруживаются крайне редко, а в оформленном кале их обычно не ищут. Вследствие этого паразитологический диагноз кокцидиоза устанавливается редко. Этому способствует также и то, что кокцидиоз встречается реже, чем другие кишечные протозойные инвазии, и ооцисты выделяются в гораздо меньших количествах, чем цисты других простейших.

Для обнаружения ооцист применяют метод флотации по Фюллеборну. Отстаивание взвеси фекалий производят40лш«— 1 ч (не больше), так как длительное пребывание в солевом растворе приводит к деформации ооцист, что затрудняет их распознавание. Определение вида кокцидий в свежих фекалиях может быть затруднено еще и тем, что ооцисты выделяются обычно незрелыми, в неспорулированном состоянии. B таких случаях фекалии рекомендуется залить 2% раствором двухромовокислого калия или 0,5% раствором хромовой кислоты и оставить при комнатной температуре. Растворы указанных реактивов губительно действуют на бактерии, но не препятствуют созреванию ооцист, которое заканчивается через

1— 4 дня, и тогда вид кокцидий может быть легко определен.

Ооцисты I. belli слабо преломляют свет, прозрачны, и по- этому их следует отыскивать и рассматривать при слабом освещении.

При кокцидиозе в кале часто обнаруживаются кристаллы Шарко—Лейдена, в крови — эозинофилия.

Определение размеров простейших. Размеры простейших и их ядер имеют важное значение для определения вида. Измерение производится при помощи окулярного микрометра, представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм. Линейка нанесена на стекло, вмонтированное или вставляемое временно в окуляр микроскопа. Значение делений окулярного микрометра по отношению к измеряемым объектам для разных систем микроскопов и разных объективов предварительно определяется при помощи объектмикрометра. Он представляет собой линейку с делениями в 0,01 мм (10 мкм) на предметном стекле. Объект- микрометр помещают под объектив микроскопа и совмещают его линейку с линейкой окулярного микрометра. Устанавливают, какое число делений окулярного микрометра точно совпадает с определенным числом делений объектмикрометра.

Рис. 17. Микрометрические линейки.

а — измерение объекта (амебы) при помощи окулярного микрометра, в котором линейка длиной 5 мм разделена на 50 частей; б — линейка объект — микрометра длиной 1 мм, разделена на 100 частей.

По этим данным вычисляют значение одного деления окулярной линейки в микронах или микрометрический коэффициент.

Например, 10 делений окулярного микрометра соответствуют 2 делениям объектмикрометра.

2-10

го деления составит—------- —

10

= 2 мкм. Вычисление микрометрического коэффициента производят C точностью до десятых или (реже) сотых долей микрона. Для измерения какого-либо микроскопического объекта сменяют обычный окуляр на микрометрический (или вставляют в него микрометрическую линейку), определяют в делениях последнего длину и ширину или диаметр объекта (тело, ядро и др.) и, перемножив число делений на микрометрический коэффициент, находят размеры объекта в микронах. Точно так же измеряются другие объекты — яйца и личинки паразитических червей, различные клетки, псевдопротозойные образования (рис. 17).

B настоящее время наша промышленность выпускает новый тип микрометра под названием микрометр окулярный винтовой AM-9-2 (MOB-l-15x). K каждому экземпляру прибора прилагается заводское описание и правила пользования.

Культуральные методы. Культивирование широко применяется для изучения морфологии и биологии простейших, действия на них лекарственных средств, получения антигенов для иммунологических исследований и других целей. Оно может быть использовано и в целях диагностики, так как позволяет существенно увеличить частоту находок кишечных и ротовых трихомонад, хиломастиксов, энтеромонад, балантидиев. Дизентерийные амебы методами культивирования обычно выявляются реже, чем путем микроскопии. B некоторых случаях культивирование позволяет выявить амеб там, где прямая микроскопия дает отрицательные результаты. Однако это может иметь лишь вспомогательное значение в диагностике амеби- аза, так как в культурах дизентерийные амебы-гематофаги не отличаются от просветных форм, что затрудняет решение вопроса о патогенной роли амеб, обнаруживаемых только методом культур. Подробнее лабораторные методы культивирования простейших изложены ниже в самостоятельном разделе.

Иммунологические методы. Эти методы пока мало разработаны и недостаточно эффективны. Для диагностики амебиаза предложена реакция связывания комплемента (РСК), реакция преципитации, внутрикожная аллергическая проба и реакция флюоресцирующих антител.

Реакция связывания комплемента разрабатывалась Крэгом (Craig). Комплементом служит свежая сыворотка крови морской свинки, гемолитическим амбоцептором — сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами человека, гемолитическим антигеном — взвесь эритроцитовчеловека. Амебный антиген представляет собой спиртовый экстракт из осадка обильных двухсуточных культур E. histolytica или богатой амебами слизи из толстой кишки собак, экспериментально зараженных амебиазом. Осадок или слизь настаивают при 37° с 7,5 объемными частями абсолютного спирта в течение 15 сут., периодически взбалтывая. Настой фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат применяют неразведенным. Амебным амбоцептором служит сыворотка крови больного амебиазом. Техника постановки PCK описана во всех руководствах по микробиологии.

Для реакции преципитации в качестве антигена применяются водные экстракты из Осадка обильных амебных культур или богатых амебами испражнений больных амебной дизентерией. Постановка реакции производится путем наслаивания на антиген в пробирке исследуемой сыворотки крови. B положительных случаях на границе соприкосновения сыворотки и антигена появляется кольцо преципитации. Такой же антиген, обязательно стерилизованный, может применяться дЛя в н у т p и к о ж н ò й реакции. Вводится он в кожу внутренней поверхности предплечья в количестве 0,1 мл. Результаты учитываются через сутки.

По отзывам специалистов из перечисленных реакций более важное значение может иметь PCK как вспомогательный метод диагностики внекишечных форм амебиаза, особенно абсцессов печени. Обычно они развиваются постепенно, как осложнения амебиаза кишечника. Клинические проявления их начинаются часто тогда, когда в кишечнике процесс давно закончился и амебы отсутствуют. PCK в подобных случаях может облегчить диагноз.

M. Э. Винников и M. Г. Денисова предложили внутрикож- ную пробу для диагностики лямблиоза. Эта проба положительно оценивалась в работах других авторов. Антиген получают путем кипячения взвеси многократно отмытых в воде лямблий из дуоденального содержимого (или культур) и вводят в кожу предплечья в количестве 0,2 мл.

Для диагностики вяло протекающих форм амебиаза, когда амебы обнаруживаются с трудом, или амебиаза внутренних органов предложен метод флюоресцирующих антител— РФА (Goldman, 1966). B модификации M. M. Соловьева и Г. С. Пшеничного (1971) реакция ставится следующим образом. Антиген готовят из 48-часовых обильных культур E. histolytica. После удаления верхнего слоя среды осадок с амебами переносят в центрифужные пробирки. Амеб, оставшихся на стенках, смывают 3—4 мл буферного раствора (0,015 M фосфатный буфер pH 7,2) и тоже сливают в центрифужные пробирки. Центрифугируют при 1500 o6jMun в течение 5 мин. Удаляют надосадочную жидкость и к осадку по каплям (при постоянном встряхивании) добавляют 5 мл 10% раствора нейтрального формалина в физиологическом растворе. Пробирку оставляют для фиксации при комнатной температуре на 30 мин, после чего добавляют 5 мл физиологического раствора, содержащего фосфатный буфер, тщательно перемешивают и центрифугируют повторно. Надосадочную жидкость удаляют, осадок снова двукратно промывают таким же раствором путем центрифугирования. Отмытый осадок взвешивают в 0,5—1 мл буферного раствора так, чтобы при микроскопировании капли взвеси в поле зрения при малом увеличении было не менее 40—50 амеб.

Ha тщательно обезжиренные смесью спирта и эфира предметные стекла восковым карандашом наносят 3 группы кружков, по 3 кружка диаметром около 8 мм в каждой, с таким расчетом, чтобы группа поместилась под стандартным покровным стеклом (18X18 мм). B каждый кружок наносят каплю амебного антигена и фиксируют высушиванием при комнатной температуре (несколько часов). B таком виде пригодность антигена для РФА сохраняется 2—3 недели при хранении в холодильнике (температура — 4—7°).

Для постановки реакции стекло погружают на 1 мин в водопроводную воду, высушивают на воздухе.

ния испытуемой сыворотки (от 1:10 до 1:320) и инкубируют во влажной камере при 37° в течение часа. После этого стекла промывают 10 мин в 3 сменах буферного раствора, погружают на несколько секунд в водопроводную воду и высушивают. B каждый кружок наносят по капле рабочего разведения лю- минесцирующей сыворотки против глобулинов человека (производит Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Га- малеи AMH СССР) и снова инкубируют во влажной камере при 37° 1 ч. Повторно промывают 10 мин в 3 сменах буферного раствора и погружают на 10 мин в 0,01% раствор красителя синего Эванса (производства Reanal, Венгрия) на таком же растворе. Препараты промывают в 2—3 сменах водопроводной воды и высушивают. Ha середину каждого кружка наносят каплю смеси из 9 частей глицерина и 1 части буферного раствора, покрывают покровными стеклами.

Препараты изучают в люминесцентном микроскопе МЛ-2 в синей части спектра (фильтр CC-15) с объективом 40X. Кон- тролями служат препараты, инкубированные с сывороткой крови здоровых людей и с физиологическим раствором.

B положительных случаях (т. e. если препарат инкубировался с сывороткой крови больного амебиазом) по периферии амеб отчетливо выявляется яркийжелто-зеленый ободок, тогда как центральная часть их светится красным светом. По мере разведения сыворотки ободок становится все менее ярким, вплоть до полного исчезновения. При этом вся амеба. как и на контрольном препарате, светится красным светом. Титром реакции считается максимальное разведение испытуемой сыворотки, при котором обнаруживаются флюоресцирующие особи амеб.

Разные серии синего Эванса могут значительно отличаться по красящим свойствам и поэтому концентрацию красителя для каждой из них подбирают заново.

Заражение экспериментальных животных. Этот метод применяется чаще с научно-исследовательскими целями: для изучения патогенности простейших, вирулентности различных штаммов их, патогенеза и патологической анатомии, эффективности лекарственных средств и других вопросов.

Для заражения дизентерийными амебами и балантидиями обычно используют молодых 2—3-недельных крыс, морских свинок, котят, щенков, золотистых хомячков, для заражения лямблиями — мышей. Реже применяют других животных. Подходящими, но малодоступными объектами для заражения являются обезьяны.

Заражающим материалом являются культуры простейших, содержимое кишечника, испражнения, гной из абсцессов печени и другие объекты, содержащие простейших.

Заражение амебами и балантидиями наиболее эффективно осуществляется путем впрыскивания с помощью шприца жидкого заразного материала в слепую кишку после лапаротомии предварительно наркотизированного животного. Для предотвращения бактериальной инфекции после заражения в брюшную полость вводят антибиотики и разрез наглухо зашивают. Возможно также перанальное впрыскивание через тонкую длинную пластмассовую трубочку, вводимую до уровня слепой кишки. Д. П. Сванидзе (1959) предложил метод наложения у молодых кроликов фистулы слепой кишки, через которую производится заражение и контроль за его результатами. Заражение лямблиями (их цистами) производят путем введения жидкого заразного материала непосредственно в пищевод через тонкую стеклянную канюлю, изогнутую под тупым углом и соединенную посредством резиновой трубки со шприцем.

Технически наиболее простой способ заражения — скармливание животным заразного материала, примешанного к пище. Недостатком его является неточность дозировки возбудителя и низкая эффективность. Малоэффективно также заражение путем вливания жидких материалов через катетер в прямую кишку после очистительной клизмы.