Культивирование лейшманий и трипаносом.

Из многих предложенных для этих целей сред для культивирования лейшманий наиболее подходящими являются следующие:

NNN-arap по Novy, Mac Neal, Nicolle. 14 г сухого агара растворяют при нагревании в 1000 мл 0,6% раствора NaCl, разливают в пробирки по 3—4 мл, стерилизуют.

Материалом для посева может служить кровь, стерильно полученная путем укола, жидкость из нераспавшихся кожных лейшманиозных бугорков или инфильтрата вокруг язвы, пунк- тат костного мозга грудины, селезенки, лимфатических узлов, содержимое кишечника москитов и т. п.

Кровь из вены берут в количестве 8—10 мл, разводят в 5—6 раз физиологическим раствором с цитратом натрия (1 мл 3,8% цитрата на 10 мл крови), центрифугируют 5 мин при 750— 1000 об/мин. Затем отсасывают пипеткой жидкую часть и поверхностный белесоватый слой осадка, в котором содержатся лейкоциты и паразиты, центрифугируют еще 10 мин при 1500— 2000 об/мин. Для посева используют нижний слой надосадочной жидкости и осадок. Пунктаты и содержимое желудков москитов перед посевом разводят в 1—2 мл физиологического раствора. Посевы производят на возможно большее число пробирок CO средой (6—8), внося материал в конденсационную воду.

Наиболее подходящая температура для роста лейшманий — 22—25°.

2— 3-й день, а при скудном содержании в посевном материале и значительно позднее — на 7—10-й день после посева. Лейш- мании растут не только в конденсационной воде, но и на поверхности агара в виде каплеобразных колоний. При длительном культивировании пересевы производят через каждые две недели. Ha всех этапах культивирования необходимо строгое соблюдение стерильности, так как лейшмании в присутствии бактерий на питательных средах быстро погибают.

Разными авторами предложен ряд других сред для культивирования лейшманий. Многие из них являются модификациями среды NNN-arap.

Среда Роджерса. Заслуживает внимания как наиболее простая по составу. Физиологический раствор с добавлением 8% лимоннокислого натрия разливают в маленькие пробирки по 1 мл, стерилизуют в автоклаве. B засеваемые пробирки вносят кровь исследуемого больного по 0,5—1 мл. Лептомонадные формы лейшманий появляются в заметных количествах на 3— 4-й день инкубации при 22—25°.

Трипаносомы человека и млекопитающих культивировать значительно труднее, чем лейшмании. Насредахдлялейшманий относительно легко получаются только культуры Trypanosoma cruzi. Для прочих видов трипапосом предложены среды другого состава.

Среда Рашки и Райхенова, предложенадляГг^/ра- nosoma gambiense. Готовят и применяют ее следующим образом. B центрифужные пробирки наливают по 1 мл раствора Рингера (0,6% NaCl, 0,01% KCI, 0,01% CACl2, 0,01% NaHCO3, 0,005% MgSO4, pH 7,2—7,4), стерилизуют в автоклаве, после чего добавляют 1 мл цитратной крови человека (1 часть целыюй крови и 1 часть 3% цитрата натрия в 0,8% NaCl). Готовые пробирки после проверки на стерильность засевают, вводя по 1 капле исследуемой крови на пробирку. B момент посева для предотвращения роста случайно попадающих бактерий можно добавлять по 500 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл среды. Культивируют при 24—26°. Трипаносомы обнаруживаются на

3— 4-й день после посева.

Культуры Trypanosoma rhodesiense были получены на плевральной среде и агаре с крысиной кровью. Эти среды предложили еще в 1912 г. Thomson a. Sinton; они готовятся аналогично среде NNN-arap. Bayon (1912) предложил для Tr. cruzi среду следующего состава: агар—15 г, глюкоза—10 г, водопроводная вода — 1000 мл.

Смесь стерилизуют в пробирках и смешивают с двойным объемом дефибринированной кроличьей крови.

Из других сред наиболее подходящими для выделения и длительного культивирования трипаносом являются.

Среда Вейнмана (D.Weinmann,1946) длnT.gambiense и T. rhodesiense — плотный кровяной агар с цитратной плазмой крови человека. Приготовляют сначала основу, содержащую на 1 л дистиллированной воды 31 г мясопептонного агара 1,5% (или агара Дифко), pH 7,3. После автоклавирования и осту- живания к 75 мл основы добавляют 25 мл смеси равных частей цитратной плазмы крови, инактивированной при 56° в течение 30 мин, и эритроцитов человека. Тщательно перемешивают. Разливают во флаконы или скашивают в пробирках. Макроскопически заметные колонии на поверхности агара появляются обычно на 5-й день, а при скудном посеве (10—100 экземпляров простейших)—только к 10-му дню инкубации. Они слегка выпуклые, круглые, бесцветные, прозрачные, мелкие—1—2, редко до 4 мм в диаметре. Содержат сотни, иногда тысячи подвижных трипаносом. Интенсивный рост продолжается до 10 суток, прекращается к 35—40-му дню, но иногда может продержаться до 60 суток после посева.

Среда LIT для T. cruzi (по J. Nobuco, 1975). Жидкая. Смесь из печеночного экстракта — 4 г, триптозы (триптон) — 5 г, двузамещенного фосфорнокислого натрия — 8 г, хлористого натрия 4 г, хлористого калия — 0,4 г, глюкозы — 2 г, сыворотки крови быка — 200 мл — доливают дистиллированной водой до 1 л. Инактивируют при 62° в течение 1 ч. После охлаждения добавляют 20 мл раствора гемоглобина (готовится прибавлением к 10 мл осажденных эритроцитов быка 90 мл дистиллированной воды), доводят pH до 7,2, стерилизуют фильтрацией через фильтр Зейца под давлением. Готовую смесь разливают в пробирки или колбы Эрленмейера по 10 мл. Обильный рост трипаносом отмечается уже на 2—4-е сутки после посева.

Посевы для выращивания трипаносом производят путем введения в пробирки или колбы со средой одной капли исследуемой крови, жидкой культуры или смывов с культур на плотной среде. Выращивание наиболее эффективно при температуре 26—28°. Засеянные пробирки, особенно с плотными средами, необходимо тщательно герметизировать для предотвращения высыхания.