ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРАЗИТИЧЕСКИХ ПРОСТЕЙШИХ КИШЕЧНИКА
Наиболее распространенными и эффективными методами диагностики кишечных протозойных инвазий и исследования простейших кишечника являются:
1. Протозооскопия — исследование с помощью обычного и фазовоконтрастного микроскопа нативных мазков, а также обработанных и окрашенных гистологическими красками так называемых постоянных препаратов.
2. Культивирование — посев материалов на питательные среды и микроскопическое исследование их после инкубирования в термостате.
3. Иммунологические методы — постановка реакций связывания комплемента (PCK) и преципитации с сывороткой крови больного и антигенами из простейших, внутрикожные пробы, метод флюоресцирующих антител.
4. Заражение лабораторных животных.
Протозооскопия. Метод этот наиболее простой, быстрый, доступный и вместе с тем эффективный, а потому чаще всех других применяется в практических лабораториях.
а) Приготовление и исследование нативных мазков. Нативные мазки исследуют необработанными или обработанными различными красящими веществами, чаще всего йодом. Готовят нативный мазок следующим образом. Ha предметное стекло наносят большую каплю исследуемого жидкого материала — водянистых или слизистых фекалий, содержимого двенадцатиперстной кишки, гноя, крови, мокроты. Каплю покрывают тщательно очищенным покровным стеклом, которое удерживают за ребрышки, во избежание загрязнения. Если исследуемый материал густой и недостаточно прозрачный, то на предметное стекло предварительно помещается капля физиологического раствора. Затем при помощи деревянной лучинки (или стеклянной палочки, что менее удобно) длиной до 15 см и толщиной 2—4 мм в этой капле готовят равномерную не слишком густую, но достаточно насыщенную взвесь исследуемого материала, которую покрывают покровным стеклом. Для приготовления взвеси стараются выбрать комочки слизи, прожилки крови и другие патологические элементы, если они имеются.
Готовый препарат немедленно исследуют под микроскопом. Результаты получаются точнее, если препарат исследовать подогретым до 37°, для чего используют специальные нагревательные столики (рис. 10).Одна из конструкций нагревательного столика-термостата, предложенная Д. В. Волжинским (1950), представляет собой металлический цилиндрический корпус, соответствующий по размерам и форме предметному столику микроскопа МБИ-1 и аналогичных ему. Корпус устанавливается вместо предметного столика на этих микроскопах. B основании корпуса имеется круглое стеклянное окно; через него из конденсора направляется свет для освещения
Рис. 10. Микроскоп с нагревательным столиком.
I — корпус столика; 2 — крышка корпуса; 3 — подвижный диск со сменной объективной втулкой; 4—рамка для предметного стекла; 5 — наружная часть колодки; 6 — термометр; 7 — электропровод к трансформатору; 8 — отверстие для объектива.
препарата. Сверху корпус герметически закрывается крышкой, благодаря чему создается замкнутая камера для исследуемого препарата. Крышка снабжена подвижным диском со сменной втулкой для объектива, что дает возможность просматривать весь препарат. Для этого последний вместе с рамкой для предметного стекла помещают в камеру через специальную прорезь в боковой стенке столика-термостата. B корпус столика вмонтирован электронагреватель, закрытый панелью, на которой укреплен терморегулятор. Нагреватель соединен проводами с трансформатором и реле, находящимися отдельно в упаковочном ящике, служащем также для хранения столика-тер-
мостата в нерабочем состоянии. Столик может присоединяться к электросети напряжением 127 и 220 В.
Внутри корпуса располагается колодка с лупками для воды. Испарение ее создает высокую влажность в камере, что предохраняет изучаемый препарат от высыхания.
Для микроскопического изучения препарата объектив микроскопа вводится в отверстие подвижного диска крышки. При малом диаметре оправы объектива в отверстие предварительно вставляют переходную втулку *.
При отсутствии столика-термостата можно осторожно подогревать препарат над электрической лампой, над пламенем спиртовки или даже на тыльной стороне кисти исследователя. Подогретый препарат быстро устанавливают на предметный столик и исследуют, как обычно.
Bce простейшие кишечника и их цисты в нативных неокрашенных мазках бесцветны и отличаются от окружающей среды лишь по светопреломляемости. Однако вегетативные формы обладают характерной для каждого вида подвижностью, что позволяет легко обнаруживать их. Внутренняя структура живых вегетативных форм более отчетливо выявляется при так называемом витальном окрашивании растворами кислых или основных красителей в физиологическом растворе хлористого натрия. Из кислых красителей хорошие результаты дает трипановый синий (1:5000—1:10 000), из основных — янусовый зеленый (1:10 000— 1:500000), нейтральный красный (1:200000), метиленовый синий (1:1000—1:10000). Препараты для исследования с витальными красителями готовят и микроскопируюттак же, как и с физиологическим раствором.
Нативный мазок, обработанный йодом, приготовляется так же, как и мазок с физиологическим раствором, но вместо последнего используют модифицированный раствор Люголя.
Приготовление и состав раствора Люголя: в нескольких миллилитрах дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, добавляют 1 г кристаллического йода, который также растворяется, после чего раствор доливают дистиллированной водой до 75 мл. Хранят его в склянках темного стекла с притертой пробкой.
Окрашивание простейших в йодном мазке происходит уже через 1—2 мин после приготовления. B йодных препаратах легко распознаются цисты простейших, так как йод избирательно окрашивает ядерные структуры, гликогеновые вакуоли, различные фибриллярные образования и другие внутренние включения. B нативных неокрашенных мазках цисты большинства простейших имеют вид бесструктурных бесцветных пузырьков и идентифицировать их почти невозможно. Растворы йода убивают вегетативные формы простейших, последние обездвиживаются, деформируются и поэтому заметить их в йодных препаратах, наоборот, труднее, чем в мазках с физиологическим раствором.
[2]Микроскопическое исследование мазков производится сначала при малом увеличении (объективы 8—10, окуляр 10). Крупные оживленно подвижные виды простейших, например Balantidium coli, легко обнаружить и распознать уже при этом увеличении. Для определения мелких простейших других видов требуется исследование при большом увеличении без иммерсии (объектив 40, окуляр 10). Исследование нативных мазков с иммерсионным объективом неудобно и применяется редко.
При микроскопировании нативных мазков обращают внимание на форму, особенности движения простейших, наличие и характер включений и другие детали. B мазках, окрашенных раствором Люголя, обращают внимание на форму тела, а также особенности строения и число ядер в цистах, наличие и форму парабазальных тел, различных фибрилл, размеры, форму, интенсивность окраски гликогеновых вакуолей.
Изучение живых простейших производится также методами фазово-контрастной микроскопии и аноптральной микроскопии, подробное описание которых дается в специальных руководствах по микроскопической технике.
б) Методы концентрации цист (методы обогащения). При скудном содержании цист простейших в исследуемом материале применяют различные методы концентрации их, основанные на всплывании цист в растворах с высоким удельным весом (флотация) или осаждении в жидкостях с низким удельным весом. Эти методы получили также название методов обогащения. Наиболее распространенными из них являются следующие.
Флотация сернокислой медью. Суспензию фекалий в водопроводной воде (1 : 10) процеживают через металлическое сито или один слой марли в центрифужную пробирку до 10 мл и центрифугируют 3—4 раза по 1 мин, при 1500—2000 об/мин, заменяя каждый раз 2—3 мл надосадочной жидкости соответствующим объемом чистой воды, с которой осадок смешивается энергичным встряхиванием. Затем к осадку добавляют 2—3 мл насыщенного раствора медного купороса (сернокислая медь, удельный вес 1,2). Содержимое пробирки тщательно перемешивают, пробирку доливают до краев и центрифугируют 1 мин.
Цисты при этом всплывают и концентрируются в поверхностной пленке, которую снимают гельминтологической петлей (см. стр. 93) и исследуют в мазках с раствором Люголя, разведенным водой в 5 раз. При пользовании неразведенным раствором цисты сильно перекрашиваются и, кроме того, получается муть, затрудняющая микроскопирование. P. С. Сафаралиев (1963) рекомендует применять для этой цели насыщенный водный раствор йода.Флотация сернокислым цинком производится так же, как и с медным купоросом. Флотирующая жидкость — 33% раствор сернокислого цинка (удельный вес 1,18).
Рис. 3. Стадии развития малярийных плазмодиев в мазкс крови (по H. А. Деминой, 1968).
Мазок крови: с возбудителем трсхдневноії малярии {a). четырехдневиой малярии (б), тропическои малярии (в). ovate-малярии (г).
/ — кольцо; 2—3 — шизонты; 4—морула; 5 — макрогаметоцит; Р'—микрогаметоцит.
K crnp. 9.
Рис. 4. Стадии развития малярийных плазмодиев в толстой капле (по H. А. Кассирскому и H. H. Плотникову, 1959; H. А. Деминой, 1968). Возбудители: трехдневной {a), четырехдневной (б), тропической (e) малярии и ovale-
малярии (г).
K crnp. 13.
Рис. 4,e, г. (Продолжение).
г
Рис. 15. Цисты кишечных простейших, окрашенные раствором Люголя (по
А. Ф. Тумке, 1947).
1—3 — Entamoeda coli\ 4—6 — E. histolytica; 7—9 — E. Harlmanni; 10—12 — Jodamoeba buetschlii; 13—15 — Endolimax папа; 16—18 — Lamblia intesiinalis, 19—Chilomastix mes- nili; ‘20—22 — грибы Btastocystis hominis.
K cmp. 49.
Флотация растворами сахара. Впервые данная методика предложена Cropper и Row (1917), в последующем видоизменялась рядом авторов. Концентрация сахара во флотирующей жидкости доводится до удельного веса 1,09 (30% раствор).
Комочек кала величиной с грецкйй орех размешивают с небольшим количеством воды и полученную эмульсию тщательно взбалтывают с 500 мл воды. Эту взвесь отстаивают в высоком цилиндре в течение 15 мин, после чего удаляют образовавшийся небольшой пенистый верхний слой, а оставшуюся жидкость отсасывают сифоном и отстаивают затем в другом высоком цилиндре 5—6 ч или центрифугируют. Осадок, получившийся после центрифугирования или отстаивания, перемешивают с флотационным раствором из расчета 14 мл раствора на 2 мл осадкя Центрифугируют 3 мин при 3000 об/мин. Цисты скапливаются в верхнем слое жидкости, который отсасывают пипеткой, смешивают с 40 мл воды и снова центрифугируют. Микроскопическому исследованию подвергают осадок. B растворах сахара цисты сохраняются жизнеспособными дольше, чем в растворах сернокислой меди или цинка.Осаждение в эфирно-формалиновой смеси. Первичная водная суспензия фекалий готовится, как для флотации медным купоросом. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок размешивают в пробирке в 10 мл 10% формалина и отстаивают 5 мин. Добавляют 3 мл эфира, закрывают пробирку пробкой и энергичным встряхиванием перемешивают содержимое, после чего пробку извлекают и смесь центрифугируют 2 мин при 1500 об/мин. B результате центрифугирования смесь разделяется на 4 слоя. Три верхних слоя сливают, а нижний (осадок) исследуют под микроскопом в мазках с раствором Люголя.
Как уже указывалось, даже цисты в результате процедур по обогащению погибают и частично подвергаются деструкции. Вегетативные же формы простейших при этом совершенно разрушаются и поэтому указанные методы для обнаружения их непригодны.
в) M e т о д к о н с e p в а ц и и. Материалы, содержащие цисты и вегетативные формы простейших, можно консервировать в специальных жидкостях, что дает возможность производить диагностические исследования спустя значительные сроки после взятия материала от больного.
Наибольшее распространение получили следующие консерванты, применяемые для этих целей.
Раствор Барбагалло (смесь из 3 частей формалина и 97 частей физиологического раствора). Одна часть консервйруемого материала смешивается с 3—4 частями раствора. Смесь хранится в плотно закрытой посуде. Цисты дизентерийной амебы сохраняются без изменений сТруктуры в течение двух недель, цисты других видов простейших кишечника — многие годы.
Однако гликогеновые вакуоли в цистах при этом быстро выщелачиваются. Вегетативные формы простейших сохраняются менее продолжительное время. Для исследования готовят мазки, окрашенные раствором Люголя.
Более эффективны следующие смеси, в которых одновременно с консервированием происходит и окраска простейших:
Консервирующая жидкость no P. С. Сафаралиеву (1963):
Метиленовый синий ....................................................................... 2 г
2% раствор сернокислого цинка.................................... 82,5 мл
Формалин.............................................................................................. 10.. »
Уксусная кислота крепкая ............................................ 5.. »
Фенол.................................................................................................... 2,5.. г
Реактивы смешивают в порядке, указанном в прописи. Фенол перед добавлением расплавляют на водяной бане. Одну часть исследуемого материала смешивают в пробирке с тремя частями консерванта. Простейшие окрашиваются уже через
5— 10 мин и вместе с твердыми частицами оседают на дно. Для исследования каплю осадка пипеткой переносят на предметное стекло и покрывают покровным. Микроскопируют с иммерсионным объективом. Цитоплазма простейших окрашивается в бледно-синий, ядро — в интенсивно-синий цвет; пищеварительные и гликогеновые вакуоли остаются бесцветными. Bo избежание перекрашивания простейших В. Б. Сченснович (1968) рекомендует уменьшить количество добавляемого метиленового синего (0,5 г и меньше).
Консервирующая жидкость по А. А. Турдыеву (1967);
Раствор Люголя крепкий (2 %)................................. 8.. »
Формалин.......................................................................... 10 »
Глицерин.............................................................................. 2.. »
Уксусная кислота крепкая........................................... 2-3 капли
0,2% водный раствор азотистокислого натрия 80 мл
Смешивают одну часть материала с 3 частями консерванта
По данным автора, после 6—8 мес. хранения материала, консервированного в этой смеси, в цистах простейших происходят дегенеративные изменения.
Консервирующая жидкость no Bucki с соавт. (1953):
Спирт метиловый............................................................... 75 мл
Формалин.................................................................. . 5 »
Кислота уксусная ледяная .............................................. 2,5... »
Фенол расплавленный....................................................... 2,5... »
Вода дистиллированная..................................................... 15 »
Яркий крезиловый голубой (Brilliantkresylblau) 2 г
Brilliantkresylblau растворяется в метиловом спирте, после чего в раствор добавляются остальные ингредиенты в порядке, указанном в прописи.
Консервирующая жидкость no Basnuevo с соавт. (1955): Готовят основной раствор, способный сохраняться длительное время. По мере надобности из него приготовляют рабочий раствор.
Состав основного раствора:
Метиленовый синий ............................................................................. 2... г
Спирт 95°............................................................................................. 40 мл
Фенол..................................................................................................... 8.. »
Вода дистиллированная .................................................................... 40.. »
Формалин............................................................................................ 10.. »
Рабочий раствор:
Основной раствор................................................................................. 1 мл
Фенол................................................................................................... 0,2.. »
Вода дистиллированная..................................................................... 89.. »
Формалин............................................................................................ 10.. »
Консервируемые фекалии смешивают с консервантом в соотношении 1 :3 и хранят в плотно закрытой банке или пробирке.
Американские авторы Brook и Goldman (1949) предложили консервирующую смесь с поливиниловым спиртом (PVA). Смесь предназначена для фиксирования фекалий с целью последующей окраски. Состав этого консерванта-фиксатора (жидкость PVA) следующий:
Глицерин . ..................................................................................... 1,5 мл
Ледяная (или крепкая) уксусная кислота . . . 5 мл
Жидкость Шаудина....................................................................... 93,5 »
Поливиниловый спирт (порошок) . ............................................. 5 г
Поливиниловый спирт растворяют в приготовленной жидкости при подогревании на водяной бане до 75°.
Консервируемый по этому методу материал размешивают в 3—5 частях фиксатора и хранят в плотно закрытой банке. Для микроскопического исследования готовят препараты, размазывая каплю смеси на предметном или покровном стекле. Препарат сушат в термостате при 37° в течение 3 ч или дольше После высушивания его проводят через 70° спирт с йодом, ополаскивают в 70° спирте, протравливают в железоаммиачных квасцах, окрашивают гематоксилином по Гайденгайну (см. стр. 289) и заключают в канадский бальзам.
Bertone (1960) описал метод консервации, окраски и концентрации простейших (и яиц глистов) в растворе мертиолат- йодформалина (жидкость MJF) следующего состава (в мл):
Вода дистиллированная................................................................... 250 мл
Раствор мертиолата № 99 1 : 1000 .................................. 200.. »
Формалин............................................................................................ 25.. »
Глицерин................................................................................................ 5.. »
Жидкость сохраняют в темной плотной закрытой склянке. Отдельно готовят 5% раствор Люголя, который хранят не дольше трех недель.
Непосредственно перед применением смешивают 1,35 мл жидкости MJF и0,15 мл раствора Люголя. B полученной смеси тщательно размешивают 0,25 г фекалий, отстаивают и исследуют под микроскопом каплю из верхнего слоя осадка. B случаях, если количество простейших (или яиц глистов) скудное, смешивают вдвое большие количества фекалий и жидкости. Смесь фильтруют через марлю в центрифужную пробирку, добавляют 4 мл эфира, закрывают пробкой, энергично перемешивают встряхиванием, затем открывают пробку и центрифугируют в течение 1 мин при 1600 об/мин. После этого микроскопи- руют каплю осадка.
г) Приготовление и микроскопирование постоянных препаратов. Наиболее распространена и дает наилучшие результаты окраска постоянных препаратов железным гематоксилином по Гайденгайну.
Постоянные препараты готовят на предметных или покров- дых стеклах. Покровные стекла необходимо выбирать тонкие, пригодные для микроскопии с иммерсионным объективом. Све- жевзятый исследуемый материал наносят на стекло при помощи деревянной лучинки и быстро, одним движением, делают равномерный тонкий мазок. Из кроваво-слизистого стула или гноя выбирают комочки слизи с кровью, Если стул жидкий, водянистый и мазок из него плохо удерживается на стекле при фиксации и дальнейших процедурах, то на стекло предварительно наносят каплю сыворотки крови человека, лошади или другого животного или нативного яичногобелка и смешивают с такой же или более крупной каплей исследуемого материала, после чего размазывают тонким, слоем на стекле. Главное требование— фиксация препарата влажным, пока он не успел высохнуть после приготовления, и сохранение его влажным на всех этапах дальнейшей обработки, при перенесении из раствора в раствор. При подсыхании мазка после его приготов- ления до фиксации простейшие сразу же дегенерируют и структура их изменяется настолько, что распознать их потом невозможно. Поэтому, как только материал нанесен на стекло, последнее сразу же укладывают мазком вниз на фиксирующую смесь ШаудИна, заранее налитую в чашку Петри или фотографическую кювету. Рекомендуется фиксирующую жидкость предварительно подогревать до 40—50°. Фиксация продолжается 15 мин (дальнейшая обработка препарата проводится так, как указано в разделе VI «Микроскопическая техника»).
B гистологических срезах тканей и мазках можно определить большинство видов простейших и при окраске их другими методами, принятыми для этих целей.
Готовые постоянные препаратымикроскопируютприбольших увеличениях, с применением иммерсионных объективов. Сначала отыскивают наиболее подходящий участок препарата при малом и среднем увеличениях, а затем исследуют его более подробно под иммерсионным объективом.
Окраска железным гематоксилином по Гайденгайну — весьма трудоемкий и длительный процесс, поэтому в практических лабораториях для массовой диагностики она используется редко. Однако в окрашенных по этому методу препаратах четко выявляются детали ядерных и цитоплазматических структур простейших, в связи с чем данный метод незаменим в научных исследованиях по морфологии простейших, при приготовлении препаратов для учебных целей, а в особо сложных и ответственных случаях применяется и для диагностики кишечных про- тозойных инвазий.
д) Д и а г н о з п p о с т e й ш и x к и ш e ч н и к а н а о с н о в e микроскопии. Микроскопическая картина нативных и постоянных препаратов, приготовляемых для обнаружения простейших кишечника, весьма вариабельна. Она зависит от видовых особенностей морфологии и биологии простейших, способа приготовления препаратов и других условий.