Б. Механизм связывания акридинов и их аналогов с нуклеи­новыми кислотами.

В экспериментах in vitro было продемонст­рировано, что связывание профлавина (10.7) (3,6-диаминоакри­дин) с ДНК идет по двум механизмам: во-первых, по реакции первого порядка, в которой равновесие достигается при соотно­шении 4 или 5 нуклеотидов на одну молекулу профлавина, и, во-вторых, в результате более медленной реакции высокого порядка, в которой одна молекула профлавина связывается с одной молекулой нуклеотида [Peacocke, Skerrett, 1956].

2-Антрилгуанидин

(10.21)

Этндий

(10.23)

В 1961 г. Lerman предположил, что молекулы 3,6-аминоак- ридина более прочно присоединяются к ДНК, благодаря интер­каляции между двумя слоями пар азотистых оснований, при этом первичные аминогруппы связываются ионной связью с двумя остатками фосфорной кислоты в спирали Уотсона — Кри­ка, а плоский скелет акридинового цикла удерживается на мо­лекулах пурина и пиримидина ван-дер-ваальсовыми силами [Lerman, 1964а]. На рис. 10.7 представлена эта структура (вид сбоку). Необходимость большой плоскости поверхности и высо­кой степени ионизации у молекул, обладающих антибактери­альным действием, очевидно, и объясняется образованием этой структуры.

По данным рентгеноструктурного анализа слои азотистых оснований ДНК обычно связаны между собой сверху и снизу

Рис. 10.7. Схема вторичной структуры нор­мальной ДНК (слева) и ДНК, включающей интеркалироваиные молекулы профлавина (справа). Спираль рассматриваетси с отдален­ной точки под таким углом, что видны лишь боковые проекции пар азотистых оснований и интеркалированиых молекул профлавина, а фосфорибозильный остов выглидит как регу­лярная спираль.

ван-дер-ваальсовыми силами. Расстояние между центрами ато­мов соседних пар оснований в цепи составляет 0,336 нм. Это означает, что молекулы аминоакридинов, имеющие точно такую же толщину, что и пуриновые и пиримидиновые основания, могут проникать в оставшиеся 0,336 нм (от общего расстояния 0,672 нм). Это пространство может образоваться за счет не­большого раскручивания двойной спирали (угол поворота варьируется для каждого вещества; так для этидиума он со­ставляет 26° [Wang, 1974], для профлавина и алкалоида зллип- тицина он несколько меньше [Kohn et al., 1975]).

Теперь рассмотрим, как Lerman пришел к теории интерка­ляции. При взаимодействии профлавина с ДНК происходит трехкратное увеличение вязкости. Это объясняли тем, что внед­ряющиеся молекулы не только вытягивают спираль, но и дела­ют ее жесткой и спрямленной. Было установлено, что комплекс ДНК —профлавин имеет более низкий коэффициент седимен­тации, чем свободная ДНК- Это происходит за счет потери массы на единицу длины (ОММ профлавина составляет менее половины массы равного объема ДНК). Эти результаты были получены в разбавленном водном растворе. Было также обна­ружено, что нити, вытягиваемые из комплекса, дают значитель­но более простые рентгенограммы, чем получаемые для чистой ДНК. Меридианальный рефлекс, соответствующий расстоянию 0,34 нм между соседними слоями, сохраняется, но новые поло­жения первых экваториальных рефлексов свидетельствуют о том, что каждая молекула ДНК теперь имеет более плотную упаковку, а следовательно, и меньший диаметр, чем молекула чистой ДНК [Lerman, 1961]. В 1963 г. Lerman показал, что соотношение интенсивностей флуоресценции движущегося и неподвижного раствора согласуется с представлением о перпен­дикулярном расположении молекул акридина по отношению к оси спирали. Затем он обнаружил резкое падение скорости диазотирования первичных аминогрупп профлавина в присутст­вии ДНК- Это означало, что ДНК защищает аминогруппы от действия азотистой кислоты [Lerman, 1964].

Теория интеркаляции была подтверждена данными, получен­ными другими методами. Так, радиоавтография ДНК (содер­жащих [³Н]тимин), выделенной из Т2-колифага, проводилась до и после погружения в разбавленный раствор профлавина. При этом было показано, что аминоакридин удлиняет молекулу ДНК от 45 до 75 мкм [Cairns, 1962]. Столь же убедителен был и тот факт, что благодаря интеркаляции профлавина темпера­тура плавления (Т_т) ДНК повышалась на 20°, а при «расплав­лении» комплекса происходило внезапное выделение большей части связанного профлавина (т. е. нити двойной спирали раз­делялись) [Chambron, Daune, Sadron, 1966]. Впоследствии это явление было подтверждено Kleinwachter, Bakarova, Bohacek (1969).

Прямое доказательство правильности теории интеркаляции было получено при рентгеноструктурном изучении комплекса профлавин — ДНК., показавшем, что молекула аминоакридина располагается параллельно парам оснований ДНК в соотно­шении 1:3 [Neville, Davies, 1966]. Исследование растворов комплексов пяти моноаминоакридинов с ДНК методами линей­ного и кругового дихроизма подтвердило, что катионы акриди­на лежат в плоскостях, параллельных тем, в которых находятся пары оснований [Jackson, Mason, 1971]. И наконец, было обна­ружено, что свободная энергия связывания аминоакридинов с ДНК близка энергии, характерной для процессов интеркаля­ции, но слишком высока для любого другого вида связывания на внешней стороне цепей ДНК [Jordan, 1968].

С точки зрения электростатических взаимодействий область ДНК, доступная для интеркаляции, несет высокий отрицатель­ный заряд, образующийся не только за счет фосфат-анионов, пуриновых и пиримидиновых оснований (за исключением аде­нина) и частичных отрицательных зарядов атомов кислорода дезоксирибозы. Именно в это отрицательно заряженное прост­ранство и втягиваются катионы лекарственного вещества, поч­ти полностью нейтрализуя избыточный отрицательный заряд.

В. Другие соединения, интеркалирующие в ДНК. Как это часто случается с новыми идеями, концепция интеркаляция по­началу не получила должного признания. Однако вскоре, и это

Рис. 10.8. Интеркаляции 3,6-диамииоакридииа между слоями пар оснований ДНК. Левое кольцо акридина противостоит почти точно иад цитозином, а пра­вое кольцо — почти точно иад пиримидиновым циклом гуанина; область ван- дер-ваальсовых связей молекулы акридина обозначена сплошной линией [Ler- тап, 1964Ь].

тоже не редкость, после ее признания очень многим лекарствен­ным веществам самых разных типов стали приписывать именно этот механизм действия. Для проверки подобных утверждений был введен специальный тест на интеркаляцию, показывающий, вызывает ли исследуемое вещество локальное раскручивание двойной спирали суперспирализованной кольцевой ДНК, напри­мер ДНК колифага [Waring, 1970]. При первичном добавлении аминоакридина количество правозакрученных суперспиралей равномерно уменьшается; при достижении критического соотно­шения добавленных молекул суперспирали исчезают и ДНК превращается в раскрученное открытое кольцо, имеющее благо­даря интеркаляции большой диаметр.

Применение этого метода позволило установить, что меха­низм интеркаляции характерен для некоторых аминофенантри- динов, включая (10.23), для антималярийного препарата хин- гамин (10.31), трех карциностатических антибиотиков: ногало- мицина, даунорубицина и актиномицина D (4.38) (разд. 4.0). Однако для хлорпромазина и диэтиламида лизергиновой кисло­ты (ЛСД) такого подтверждения получено не было, хотя ранее им приписывали интеркаляционный механизм действия. Было обнаружено, что спермин, стрептомицин, диминазен и митрами- цин активно взаимодействуют с ДНК, но не образуют интерка- лятов [Waring, 1970].

Рассмотрим другие, не менее важные примеры интеркаля- ции. Парафуксин (10.5), краситель трифенилметанового ряда, интеркалирует в ДНК, однако не так плотно, как профлавин [Armstrong, Panzer, 1972]. Антибиотик эхиномицин содержит полипептидную цепь, с которой связаны два хиноксалиновых цикла, далеко отстоящие друг от друга. Эти циклы одновре­менно интеркалируют в разные участки ДНК. Происходящее вследствие этого раскручивание и удлинение спирали в два раза превышает то, которое вызывается действием аминоакри­динов [Waring, Wakelin, 1974].

Путем введения акридиновых циклов в молекулы путресци- на (11.6) и спермина (11.4) были получены синтетические ана­логи, способные ингибировать ДНК-зависимую РНК-полимера­зу и повышать температуру плавления ДНК сильнее, чем сами аминоакридины [Canellakis et al., 1976]. Противораковое дейст­вие соединений, образующих двойные интеркаляты, рассмат­ривается в разд. 10.3.4.

Биологические свойства лекарственных веществ, действие которых основано на интеркаляции, обсуждаются в обзоре [Schwartz, 1979].

Почему же аминоакридины и соединения с подобным меха­низмом действия обладают такой высокой избирательностью действия по отношению к бактериям и практически не дейст­вуют на клетки млекопитающих? Установлено, что для серии аминоакридинов характерно наличие антибактериальных свойств, высокая степень ионизации и интеркаляционный меха­низм действия [Jackson, Mason, 1971]. Избирательность их дей­ствия обусловлена, по-видимому, двумя факторами: доступ­ностью одиночных хромосом бактерий (разд. 5.3), а также тем, что эти лекарственные вещества действуют преимущественно на кольцевые ДНК [Waring, 1970]. Кроме избирательного дей­ствия на бактерии, аминоакридины действуют избирательно и на другие кольцевые ДНК: они способны отщеплять бактери­альные плазмиды [Bouanchaud et al., 1968], а также вызывать наследственные изменения у дрожжей путем подавления репли­кации ДНК в митохондриях, не затрагивая при этом ядра (разд. 10.3.1) [Hollenberg, Borst, van Bruggen, 1970].

Далее, аминоакридины и аминофенантридины могут или по­давлять кинетопласт в трипаносомах или (при более низких концентрациях) разрушать его кольцевую ДНК [Riou, Delain, 1969].

Рассчитано, что, поскольку эти лекарственные вещества уменьшают суперспирализацию кольцевой ДНК, выделение свободной энергии повышает сродство к агенту, в то время как аналогичная однонитевая ДНК имеет пониженное сродство [Bauer, Vinograd, 1970]. По-видимому, этот случай можно от­нести к проявлению избирательности за счет накопления (гл. 3).

10.3.3.