Влияние субхронического системного введения пептида TGeNHR-NH2 на характеристики рецепторного связывания на мембранах мозга мышей линий C57Bl/6 и Balb/c методом ex vivo анализа

Выбор лиганда для радиорецепторных исследований ex vivo осуществляли в соответствии с рекомендациями IUPHAR. При радиолигандном анализе NMDA- рецепторов использовали [³Н^](+)МК-801, синтезированный реакцией ВТКИО с молярной радиоактивностью 210 Ки/ммоль (Золотарев и др., 2009).

Рецепторный компонент механизма действия пептида был проведен сравнительным анализом изменения плотности NMDA-глутаматных, 5-HT_2a-серотонино- вых и н-АХ-никотиновых рецепторов на мембранах префронтальной коры и гиппокампа мозга мышей инбредных линий C57Bl/6 и Balb/c. Мыши линии Balb/c с исходным когнитивным дефицитом характеризуются меньшей плотностью исследуемых рецепторов.

Плотность мест связывания [G-³H]MK-801 с NMDA-рецепторами в гиппокампе мышей линии Balb/c меньше на 23%, чем у мышей линии C57Bl/6. Плотность мест связывания 5-HT_2a-серотониновых и н-АХ-никотиновых рецепторов на мембранах префронтальной коры мозга также оказалась на 30-35% меньшей у мышей линий Balb/c, чем у мышей линии C57Bl/6.

Ткань гиппокампа гомогенизировали в гомогенизаторе Potter S («тефлон-стекло») в 10 объемах 5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base (рН=7,6), содержащего 0,32 М сахарозу (буфер №1). Гомогенат разбавляли до 50 объемов буфера для исследования 2 (5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base) (рН=7,6) и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Супернатант отбирали и вновь центрифугировали 20 мин при 25 000 g. Осадок гомогенизировали в 50 объемах буфера 2 и центрифугировали 20 мин при 8 000 g.

Реакционная смесь содержала 200 мкл буфера 2, 50 мкл меченого лиганда (50 нМ) и 250 мкл белковой суспензии. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого лиганда. Инкубационная смесь содержала 200 мкл буфера 2, 50 мкл меченого лиганда (50 нМ) и 250 мкл суспензии белка. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого (+)МК-801. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Измерение радиоактивности осуществляли жидкостно-сцинтилляцион- ным методом на счетчике TriCarb TR290. Эффективность счета составляла 42-47%. Показатели количества мест связывания лиганда (B_max, фмоль/мг белка) и константу диссоциации лиганд-рецепторных комплексов (Kd, нМ) рассчитывали с помощью программы GraphPadPrizm 4 Demo, статистическую обработку проводили по программе Statsoft 6,0. Концентрацию белка определяли стандартным методом Лоури.

Результаты радиорецепторного анализа связывания лиганда [³Н^](+)МК801с NMDA-рецепторами, участвующими в регуляции когнитивных форм поведения, были представлены после обработки по Скетчарду (рис. 9).

Анализ влияния на NMDA-рецепторы гиппокампа мышей линии Balb/c показывает, что субхроническое введение пептида приводит к возрастанию величины

Рис. 9. График Скетчарда, отражающий влияние субхронического внутрибрюшинного введения пептида TGeNHR-NH₂ на характеристики рецепторного связывания [³H-G](+)MK-801 с NMDA-рецепторами на мембранах мозга гиппокампа мышей линии Balb/c

B_max, отражающей плотность соответствующих рецепторов, с 2115±36 фмоль/мг белка в контрольной группе до 2527±43 фмоль/мг белка после субхронического введения препарата.

После 5-кратного системного введения амидной формы пептида TGeNHR-NH₂ в ежедневной дозе 100 мкг/кг величина плотности мест связывания [G-³H]MK-801 с NMDA-рецепторами в гиппокампе мышей Balb/c увеличилась на 21% относительно интактного контроля. При этом величина плотности NMDA-рецепторов в гиппокампе мышей Balb/c приблизилась к соответствующему значению для группы сравнения, представленной мышами линии C57B1/6, относительно которой препарат был неэффективен. Субхроническое введение пептида в равной степени уменьшало плотность 5-НТ^-серотониновых рецепторов у обеих линий и не оказывало влияния на никотиновые н-АХ-рецепторы (табл. 1). Результаты, полученные при исследовании влияния амидной формы пептида HLDF-6 на нейрохимические процессы с помощью радиолигандного анализа, показывают, что в механизм этих фармакологических эффектов с высокой степенью вероятности вовлечена глута-

Таблица 1

Влияние субхронического системного введения пептида TGeNHR-NH₂ на изменение плотности глутаматных (NMDA), серотониновых (5-HT_2a) и никотиновых рецепторов

(н-АХ) на мембранах префронтальной коры и гиппокампа мозга, а также эффективность исследовательского поведения (ЭИП) мышей инбредных линий C57Bl/6 и Balb/c

матергическая система гиппокампа, в частности NMDA-тип рецепторов. NMDA- рецепторы являются одной из важнейших мишеней для воздействия ноотропных и нейропротекторных лекарственных препаратов, так как они принимают определяющее участие в регуляции уровня выживаемости и гибели

6.