ПЦР –АМПЛИФИКАЦИЯ

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:

1.

2. Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (от англ. "annealing").

Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответ­ст­вии с правилом комплементарности Чаргаффа, означаю­щим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аде­нина всегда находится тимин, а напротив гуанина – ци­тозин. Если это условие не соблюдено, то отжига прай­­меров не происходит.

После отжига праймеров Taq-по­лимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.

3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.

Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количест

Рисунок 13. Схема основных этапов ПЦР анализа.

во синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.