ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Контрольные реакции при постановке ПЦР
Внимание! При постановке ПЦР в реальном эксперименте в параллель с экспериментальной рекомендуется ставить 3 контрольные реакции. Чтобы исключить неспецифичную амплификацию с одного праймера, ставят контрольные амплификации с добавлением только одного праймера.
Это позволяет при анализе на гель-электрофорезе отличить искомый продукт амплификации от возможного фона. Кроме того, при неаккуратной работе возможна контаминация реактивов и оборудования ДНК-матрицей. Чтобы оценить уровень контаминации, ставят контрольную реакцию, в которую не добавлена ДНК-матрица.1. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, смешивая компоненты реакции в указанном порядке (объем рассчитан на 4 реакции объемом 25 мкл каждая):
80 мкл стерильная вода;
10 мкл 10х буфер для Encyclo;
2 мкл dNTP (10мМ каждый);
2 мкл Encyclo полимераза;
94 мкл суммарный объём.
2. Разделите смесь на четыре пробирки по 23 мкл и промаркируйте пробирки “Экс.” (экспериментальная) и “К1-3” (контрольные).
3. Добавьте недостающие компоненты реакции в каждую из пробирок как указано в табл. П.1.
Таблица П.1
| Компонент | Пробирки | |||
| Экс., мкл | К1 (только генспецифичный праймер), мкл | К2 (только адаптерный праймер), мкл | К3 (без ДНК- матрицы), мкл | |
| Разбавленная в 10 раз кДНК | 1 | 1 | 1 | — |
| Ген специфический праймер | 0,5 | 0,5 | — | 0,5 |
| Адаптерный праймер (смесь Step-out mix) | 0,5 | — | 0,5 | 0,5 |
| Стерильная вода | — | 0,5 | 0,5 | 1 |
Еще по теме ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Контрольные реакции при постановке ПЦР:
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
- Приложение: контрольные вопросы для подготовки к занятиям
- Приложение: контрольные вопросы для подготовки к занятиям
- Nested ПЦР и Step-out ПЦР
- При постановке диагноза раннего врожденного сифилиса грудного возраста учитываются:
- Методические рекомендации по постановке тестов ингибирования роста бактерий, выделенных в ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных
- Виды и причины осложнений после операций при раке прямой кишки в контрольной группе
- Компенсаторные реакции при гипоксии
- Эмоциональные реакции при раздражении гиппокампа.
- Эмоциональная реакция при раздражениях перегородки.
- Аллергические реакции при кандидозе
- Эмоциональные реакции при раздражении грушевидной коры.