7.4. Метилспецифическая ПЦР.
Метилспецифическую ПЦР проводили в два этапа по принципу полугнездовой ПЦР. На первом этапе ДНК после бисульфитной модификации амплифицировали с использованием праймеров adpt-bis-1 и adpt-bis-3 в конечном объеме 50 мкл в следующих условиях: 1 буфер для ПЦР, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 10 пмоль каждого праймера и 1 ед.
акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия). Амплификация проходила в следующем режиме: 94^ 30 сек, 50^ 60 сек, 72^ 90 сек, - 35 циклов. На втором этапе использовали аликвоту амплификата из первой ПЦР, неразведенной или разведенной бидистилированной водой в соотношении 1:10. Также заменяли праймер adpt-bis-1 на праймер adp-bis-2. Реакцию проводили в конечном объеме 50 мкл в описанных выше условиях.Амплификация проходила в следующем режиме: 94^ 30 сек, 52^ 30 сек, 72^ 60 сек, - 30 циклов. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. При наличие продукта ПЦР соответствующего размера, проводили его выделение из агарозы. Количественную оценку очищенного продукта ПЦР осуществляли методом электрофореза в агарозном геле, сравнивая с известным количеством ДНК-маркера X PstL Определение нуклеотидной последовательности исследуемого продукта ПЦР проводилось на автоматическом сиквенаторе в институте Молекулярной биологии им. Энгельгардта, Россия.
Еще по теме 7.4. Метилспецифическая ПЦР.:
- Nested ПЦР и Step-out ПЦР
- ПЦР ДИАГНОСТИКА. ПРОБОПОДГОТОВКА
- Результаты ПЦР кала
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
- ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
- 1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC- богатыми праймерами.
- 7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами.
- 7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами.
- Качественная ПЦР проводится
- 8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля.
- Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика отделяемого влагалища, цервикального канала