Nested ПЦР и Step-out ПЦР

При амплификации с использованием вырожденного праймера продукт ПЦР редко оказывается гомогенным. Чтобы избавиться от неспецифических продуктов, его подвергают одному или нескольким дополнительным раундам амплификации в так называемом nested ПЦР (ПЦР с заглублением).

В этом случае ПЦР проводят в присутствии адаптерного праймера и нового ген-специфического праймера, который имеет сайт отжига внутри целевой последовательности.

Если продукт nested ПЦР все еще не является гомогенным, проводят еще один раунд nested ПЦР (при наличии еще одной «заглубленной» последовательности, на которую может быть написан следующий праймер).

Одновременно с Nested ПЦР для подавления неспецифической амплификации осуществляют Step-Out ПЦР (рис. 2.3). Каждый следующий раунд амплификации проводят на новой смеси Step- Out mix, где 3'-фрагмент супрессионного адаптера комплементарен последовательности фланкирующей кДНК (продукт ПЦР), а 5'- конец представляет собой новую адаптерную последовательность. Короткий праймер соответствует этой новой адаптерной части длинного праймера. Таким образом, на каждом новом раунде амплификации, одновременно с «заглублением» в изучаемый ген (в нашем случае - ген флуоресцентного белка), осуществляется переход на новый «внешний» адаптерный участок на 3'- конце молекулы кДНК.

Если после нескольких раундов амплификации получается гомогенный продукт предсказанного размера, переходят к его клонированию и секвенированию. Полученную в результате информацию о нуклеотидной последовательности целевого фрагмента, используют при дизайне ген-специфических праймеров (без вырожденных позиций) для клонирования недостающих фрагментов целевого гена, например 5'- концевого фрагмента (см. ниже).

Рис. 2.3. Схема быстрой амплификации 3'-концевого фрагмента целевого транскрипта в двух раундах амплификации с применением технологий nested ПЦР и step-out ПЦР. Праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности обозначены прямоугольниками. GSP - ген-специфический праймер

2.4.1.