7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами.
Обработанную метилчувствительными рестриктазами геномную ДНК (50-100 нг) амплифицировали методом ПЦР с использованием как одного статистического GC-богатого праймера, так и в случае СП-2 и СП-3 их комбинации.
Использованные в нашей работе статистические GC-богатые праймеры приведены в табл. 2. Реакцию проводили в конечном объеме 25 мкл в следующих условиях: 1X буфер для ПЦР, 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 25 пмоль праймера и 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия). В случае радиоактивного мечения продуктов ПЦР в реакцию добавляли 2 мкКи a-33P-dATP. Первые 5 циклов реакции проходили в «мягком» режиме: 94oC 30 сек, 40°C 60 сек, 72°C 90 сек. В течение следующих 30 циклов амплификацию проводили в специфическом режиме: 94^ 15 сек, соответствующая для данного праймера (см. табл. 2) 15 сек, 72^ 60 сек (Gonzalgo et al., 1997). Продукты ПЦР анализировали в высокоразрешающем 5% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. ДНК выявляли методом серебрения, если не проводили мечения продукта ПЦР (см. п. 8.3.), или экспонированием геля с рентгеновской пленкой в течение 14 дней.Выделенную из полиакриламидного геля ДНК (см. п. 8.1.) амплифицировали с использованием соответствующего праймера. Реакцию проводили в специфических условиях описанных выше. ПЦР осуществляли в течение 30 циклов в следующем режиме: 94^ 30 сек, соответствующая для праймера (см. табл. 2) 30 сек, 72^ 60-180 сек. Время элонгации определялось размером амплифицируемого фрагмента ДНК. В ряде случаев реакцию проводили в присутствии 10% глицерина или 5% ДМСО. Качественную и количественную оценку продукта ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле, сравнивая с известным количеством ДНК-маркера X PstI. Для клонирования использовали аликвоту продукта ПЦР без предварительной очистки.
Еще по теме 7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами.:
- ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
- ПОДГОТОВКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ. ПОДГОТОВКА МОКРОТЫ И МОЧИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
- ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 1 Тема: Забор и хранение клинических образцов в ПЦР-лаборатории
- ПЦР ДИАГНОСТИКА. ПРОБОПОДГОТОВКА
- 1. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- РаспространЕнность мутаций, связанных с наследственными формами рака молочной железы, среди жителей г. Новосибирска
- ОГЛАВЛЕНИЕ
- Список сокращений
- - 6 -Введение
- Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в опухолях.
- 7.1. Праймеры.
- 7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами.
- 7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами.
- 1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC- богатыми праймерами.
- Обсуждение результатов