Молекулярно-генетическое исследование

Всем пациентам при включении в исследование было проведено молекулярно-генетическое тестирование на наличие полиморфизма трех позиций промоторного региона гена ФНО-а. Исследование, выполненное на базе генетической лаборатории ОАО «Медицина», включало три этапа:

-Выделение ДНК из клинического образца

-Амплификация специфических фрагментов ДНК

-Детекция продуктов амплифкации

Для ДНК диагностики точковых мутаций и полиморфизмов используется метод аллель специфичного лигирования с последующей амплификацией.

В наборе предусмотрен один или несколько образцов ДНК для обязательного положительного контроля прохождения реакции. В случае отсутствия фрагментов амплификации в исследуемых образцах и наличия их в положительном контроле выделение ДНК из проб проводили заново.

* Выделение ДНК из цельной венозной крови ДНК выделяли по стандартной неэнзиматической методике с использованием коммерческого набора реагентов DiatomTM DNA Prep 100 (ООО «Центр молекулярной генетики», Россия) из лимфоцитов периферической крови, взятой из локтевой вены [173]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20 °С. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе.

Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови следующим образом. Однородный образец крови (50 мкл) помещали в пробирку «Эппендорф» с 1000 мкл деинизированной воды и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 10 000g и ресуспендировали, оставляя осадок и около 30 мкл надосадочной жидкости.

перемешивали на микроцентрифуге Vortex.

Полученный материал инкубировали при t=56⁰C в течение 30 минут. Повторно перемешивали на микроцентрифуге Vortex и инкубировали при t=100⁰C в течение 8 минут. После инкубации производили интенсивное встряхивание на Vortex и центрифугировали 3 минуты с ускорением 10 000g. Для проведения ПЦР брали надосадочную жидкость.

* Амплификация.

Для амплификации ДНК-фрагмента длиной 148 нуклеотидных проб с вариабельным нуклеотидом в 308 положении промоторного региона использовали следующие праймеры: 5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT- 3' и 5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3', синтезированные для исследования фирмой ЗАО "Синтол". Геномную ДНК (~ 100 нг) аплифицировали, используя 1,25 ед. Таg-полимеразы (Fermentas) в 25 мкл буфера, содержащего 75 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 20 мЫ (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween 20, 2,5 мЫ MgCl₂, 2 мЫ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) и 0,2 мкМ каждого праймера. ПЦР проводили на амплификаторе Hybaid PCR Express при следующих условиях амплификации:

Шаг 1. - 94⁰С - 2 мин,

Шаг 2 - 94⁰С - 20 сек,

Шаг 3 - 55⁰С - 30 сек,

Шаг 4 - 72⁰С - 35 сек.

Шаги 2,3 и 4 повторяли 30 раз.

Шаг 5 - 72⁰С - 2 мин.

* Рестрикция.

Фрагмент амплификации (10 мл) подвергался рестрикции с использованием рестриктной эндонуклеазы NcoI (Fermentas): 10 мкл

амплификата инкубировалось при t=37⁰C 4 часа в присутствии 5 ед. NcoI (рис. 1).

Фрагменты рестрикции анализировали методом горизонтального электрофореза в 7 % акриламидном геле (сток-раствор АА/БА 29:1).

Электрофоретическое разделение фрагментов проводили при напряженности поля 16 В/см в течение часа. В качестве контроля вместе с исследуемыми образцами наносили образцы, которые не подвергались ферментативной обработке.

Аллель ФНО- а 308 (G) давал 2 фрагмента длиной 128 и 20 нуклеотидных пар, аллель ФНО- а 308 (A) - один фрагмент - 148 н.п. Таким образом, гомозиготы по аллелю ФНО- а 308 (GG) давали два фрагмента, в то время как гомозиготы по аллелю ФНО- а 308 (AA) давали один фрагмент, а гетерозиготы (GA) - 3 фрагмента.

• Анализ полученных результатов Длина амплифицируемого фрагмента - 148 п.н.

После проведения рестрикции на геле регистрируются полосы (рис. 4):

в случае аллеля G - 128+20 п.н. в случае аллеля A - 148 п.н.

Электрофореграмма результатов амлификации с последующей рестрикцией:

1 2 3 4 5 6 7

148 п н 128 п.н.

Рис. 4. Образец до рестрикции

Маркер молекулярного веса ДНК фага X, рестрицированная PstI

генотип A/G

генотип A/G

генотип A/G

генотип G/G

генотип G/G

Контрольная ДНК - A/G

2.5.