Молекулярно-генетические методы исследования
Выделение ДНК из венозной- крови человека. 8 мл венозной крови набирали в пробирки со стандартным консервантом (І мл глюгицира) в соотношении 4:1. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984).
Для этого к 4 мл крови добавляли 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритона-Х 100, 5мМ MgCh, 10 мМ трис-НС1 pH 7,6. Ядра- осаждали центрифугированием при 4°С и 4000 об/мин в течение 20 минут; к осадку добавляли 8- мл раствора, содержащего 25 мМ EDTA (рН=8,0), суспензировали, добавляли 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл, затем инкубировали при 37°С 16 часов. Очистка ДНК от белков производилась с помощью эктракции раствора ДНК забуференным фенолом (рН=7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. При этом фенол активно денатурирует белки, смесь фенол- хлороформа полностью ингибирует РНК-зную активность, в результате последней экстракции хлороформом из препарата ДНК удаляют остаткиРОССИЙСКАЯ
.. ГОСУДАРСТВЕННАЯ
41 БИБЛИОТЕКА
фенола. Экстракцию производили, смешивая раствор ДИК и растворитель до образования эмульсии. Разделение фаз проводили ценрифугироваиием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Осаждение ДНК производилось добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осажденную ДНК дважды промывали 70% этанолом, удаляли этанол из пробирки и подсушенный осадок ДНК растворяли в деионизированной Н2О. Раствор ДНК хранили при -20°С.
Полимеразная цепная реакция. Анализ полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP2EI, CYP2D6, GSTMI, GSTTl, GSTP1, ЕРНХ1 и NAT2 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклсотидных праймеров. Перечень исследованных локусов, последовательности специфических олигонуклсотидных праймеров, способы обнаружения мутаций и полиморфизмов, а также номенклатура аллелей представлены в табл.
1. Общая схема ПЦР для большинства локусов была следующей. Реакционная смесь содержала 1,25 мкл 1 х ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl pH 8.5), 1,5 mM MgCl2, 25 mM КС1, 10 тМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% тритон Х-100), 200 мМ каждого dNTP, по 1 мкл соответствующих праймеров, примерно 100 нг геномной ДНК, 1 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим») и необходимое количество деионизированной воды до объема 12.5 мл. В случае необходимости для некоторых локусов с целью оптимизации в состав ПЦР- смеси вводились вспомогательные реагенты. Так, для локусов генов CYP1AI, GSTP1, GSTM1 дополнительно использовался 25 mM MgCl2 (Promega), а для локусов NAT2, GSTTl, EPIIX1- бычий сывороточный альбумин (Юмг/мл).Анализ генов GSTM1 и GSTTl был выполнен в стандартных условиях по ранее описанной методике (Seidegard, et. al., 1986; El-Zcin et al., 1997). При отсутствии делеции формировались фрагменты размером 271 пн и 480 пн соответственно, при наличии делеции фрагмент отсутствовал. В качестве
Основные характеристики исследуемых генов бнотрансформацни ксенобиотиков и способ их анализа
| Ген | Локали зация | Праймеры | Мутация | Номенклатура аллелей (размер ДНК-фрагментов, пн) | Способ анализа, рестрнктаза, t отжига, °С | Литератур ный источник |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| CYP1A1 | 15q22- q24 | 5' - GAACTGCCACTTGAGCTGTCT - 3* 5’ - GAAAGACCTCCCAGCGGTCA - 3’ | Экзон 7 He462Val A4889G | Нс-норма (139) Val -быстрая (120,19) | ПЦР/ ПДРФ Hindi. $5 | Oyama ct al., 1991. |
| CYP2E1 | IOq24.3 | 5* - CAGTCGAGTCTACATTGT - 3’ 5' - TTCATTCTGTCTTCTAACTG - 3' | 5’ область гсиаС1091Т | С1- норма (410) С2- быстрая (290,120) | ПЦР/ ПДРФ Pstl, 54 | El-Zeinet al., 1997. |
| CYP2D6 | 22q24 | 5’-CCATTTGGTAGTGAGGCAGGTAT- 3’ 5’- CACCATCCATGTTTGCTTCTGGT - 3’ | Экзон 1 Pro 34 Scr C188T | С-норма (213) Т-быстрая (112,101) | ПЦР/ ПДРФ AsuHPI, 57 | Kubota ct. al., 2000. |
| GSTP1 | llql3 | 5'-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3’ 5'-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3' | Экзон 5 He 105 Val A313G | 11с - норма (176) Val - медленная (91,85) | ПЦР/ ПДРФ Alw26l, 54 | Harries et. al., 1997. |
| GSTM1 | ІрІЗ.З | 5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC -3' 5’ - GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’ | Делсция | 0 - отсутвует 1 - норма (271) | ПЦР, 55 | Scidegard ct. al., 1986 |
| GSTTI | 22ql 1.2 | 5' -TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3’ 5' - CACCGGATCATGGCCAGCA - 3’ | Деления | 0 - отсутвует 1 - норма (480) | ПЦР, 59 | Their ct. al., 1999. |
Продолжение таблицы 1
| Г | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ЕРНХ1 | lq42.1 | 5' - GATCGATAAGTTCCGTTTCACC -3’ 5’ -ATCCTTAGTCTTGAAGTGAGGAT-3' | Экзон 3 Туг 113 His T337C | N-норма -1 ІЗТуг/Туг (140,22) S-мсдлсннаяІ ІЗТуг/His (162,140,22) SS-очень медленная 139 His/His (162) | ПЦІ7 ПДРФ EcoRV, 53 | Smith et. al., 1997. |
| ЕРНХ1 | lq42.1 | 5’ - ACATCCACTTCATCCACGT - 3' 5’ - ATGCCTCTGAGAAGCCAT - 3' * | Экзон 4 Hisl39Arg A415G | N*139 His/ His- норма 164,46 F-139 His/Arg6ucTpaa (210,164,46) FF-139 Arg'Arg очень быстрая (210) | ПЦР/ ПДРФ Rsal, 57 | Smith et. al., 1997. |
| NAT2 | 8р23.1- р21.3 | S’ -GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC -3' 5* - TTGGGTG ATACATAGACAAGG - 3' | Транзиция C481T Транзиция G59OA Транзиция G857A | Аллели: NAT2*4 (114,108,170,92,57) NAT2*5 (C481T) (114,433,547) NAT2*6 (G590A) (155,170,222, 392) NAT2*7 (G857A) (490,57,547) | Ґ11ДР/ ПДРФ, 58 A>/C48IT 7ag/G59OA Ram Hl G857A | Rocha ct. al., 1999. |
внутреннего контроля дополнительно амплифицнровали фрагмент 7 экзона гена CYP1A1.
Полиморфизм локусов генов CYP1A1, CYP2E1, ЕРНХ1, GSTPI исследовался методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). После амплификации ПЦР-продукты всех локусов подвергались гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции (табл. 1). Для этого проводили гидролиз амплифицированного фрагмента ДНК, включающий необходимый участок ДНК соответствующей рестриктазой фирмы «MBIFcrmentas» и «Сибэнзим» в стандартных условиях: к 20 мкл амплификата добавляли 5 единиц фермента и инкубировали при 37°С не менее 12 часов, для рестриктазы TaqI температура инкубации равнялась 65°С (табл. 1). Ниже описаны особенности молекулярногенетического анализа локусов, условия амплификации и последующего анализа которых отличались от вышеописанных.
Анализ миссенс-мутаций Тугі 13His и Hisl39Arg гена ЕРНХ1 проводился по Smith СА., Harrison DJ. (1997). Амплификация и ПДРФ- анализ каждого полиморфного локуса проводилась независимо в стандартных условиях. По результатам исследования двух мутаций определяли предполагаемый фенотип (табл. 2).
Таблица 2
Идентификации аллелей геиа ЕРНХ1 методом ПДРФ-анализа однонуклсотидных замен в позициях 139 и 113
| Комбинации генотипов | 4 з к з о u | |||
| Hisl39/Hisl39 | Hisl39/Argl 39 | Argl39/Argl39 | ||
| 3 к 3 О 11 | Туг113/Туг113 | нормальный | быстрый | быстрый |
| Tyrl 13/Hisl 13 | медленный | нормальный | быстрый | |
| Hisl 13/Hisl 13 | очень медленный | медленный | нормальный | |
Амплификация фрагмента гена NAT2 была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 2.5 мкл 1 Ох ПЦР-буфера, 2.5 мкл BSA (Юмг/мл), 400 мМ каждого dNTP, 1.5 ед Taq-полимеразы и соответствующие праймеры по 15 нМ каждого.
После денатурации (94°С, 7 мин) проводили 32 циклов амплификации в режиме: 94 °С - 1 мин, 59°С - 40 сек , 72°С - 1 мин с заключительным синтезом в течение 7 мин при 72°С. Полученный- ПЦР продукт размером 547 пн расщепляли рестриктазами Kpnl, TaqI, ВатНІ по стандартной методике и выявляли генотип по каждому локусу отдельно.Аллели гена NAT2 были идентифицированы согласно номенклатуре, предложенной Vatis К.Р.; с соавт. (1995). Определялись следующие типы аллелей: NAT2*4 (отсутствие замен), NAT2*5 (48 IT), NAT2*6 (590А), NAT2*7 (857A) (табл. 3). Идентификацию фенотипов быстрых и медленных ацетиляторов проводили с учетом генотипических вариантов: быстрые ацетиляторы (R) имели не более одного медленного аллеля (генотипы NAT2*4/*4, NAT2»4/*5, NAT2*4/*6 и NAT2*4/*7), тогда как медленные ацетиляторы (S) характеризовались наличием двух и более медленных аллелей. По результатам анализа трех локусов определяли фенотип ацетилирования по совокупности наличия медленных и быстрых аллелей.
’ Таблица 3
Идентификация аллелей гена NAT2 методом ПДРФ-анализа однонуклеоткдных замен в позициях 481* 590 и 857
| Аллели | Позиции | ||
| 481 (Kpnl) | 590 (TaqI) | 857 (BamHI) | |
| Nat2*4 | С | G | G |
| Nat2*5 | T | - | - |
| Nat2*6 | - | A | - |
| Nat2*7 | - | - | A |
Проведение электрофореза и визуализация результатов. Результаты амплификации и рестрикции оценивали с помощью вертикального электрофореза в 6-8% -ном полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и мстиленбисакриламида 29 : 1) при напряжении 200-300 В (10 В/см). В качестве элсктрофорсзного буфера использовали ТВЕ (трис- боратный буфер). По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0.1 мкг/мл) в течение 15 .мин и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве маркеров молекулярной массы использовали Mspl-фрагмснты плазмиды pUC19.
2.4.
Еще по теме Молекулярно-генетические методы исследования:
- Молекулярно-генетические методы исследования
- Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика отделяемого влагалища, цервикального канала
- Молекулярно-генетическое исследование
- Молекулярно-генетическое исследование
- 2.2.2. Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов
- Глава 4: Исследование молекулярно-генетических маркеров в неизмененной слизистой культи желудка у больных, оперированных по поводу рака в объеме резекции.
- Молекулярно-генетические маркеры.
- Молекулярно генетические аспекты канцерогенеза при раке желудка
- ГЛАВА 1. Резекция желудка в хирургическом лечении рака и роль молекулярно-генетического исследования в прогнозе развития рецидива рака желудка.
- Глава 5. Молекулярный скрининг генетического риска.
- Молекулярно-генетические болезни.
- Молекулярно-генетические маркеры, изучаемые в работе
- Генетические методы исследования - генотипирование по генам кандидатам
- 3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза
- Молекулярно-генетические особенности РМЖ в молодом и пожилом возрасте.