2.2.2. Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов

Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов – кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) – трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т – консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A – транзиция в 13 интроне и D543N – неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне.

Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20° С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).

Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Rеsearch» (США) и «БИС 108» (Россия-Новосибирск).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут.

Таблица 4

Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов

NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген	Полимор-физм	Структура праймеров	tо отжига прай-меров, оС	Фермент рестрик-ции	Продукты гидролиза, п. н.		Литерату-ра
					Аллель «дикого» типа	Мутантный аллель
1	2	3	4	5	6	7	8
NRAMP1	274C/T	5’-tgccaccatccctatacccag –3’ 5’-tctcgaaagtgtcccactcag –3’	60	Mnl I	167;37;12 bp	102;65;37; 12 bp	Liu J. et al., 1995
	469+14 G/C	5’-tctctggctgaaggctctcc –3’ 5’-tgtgctatcagttgagcctc – 3’	60	Apa I	624 bp	455;169 bp
	1465-85G/A	5’-gcaagttgaggagccaagac –3’ 5’-acctgcatcaactcctcttc –3’	60	Bsе 1I	142;75;24 bp	102;75;40; 24 bp
	D543N	5’-gcatctccccaattcatggt –3’ 5’-aactgtcccactctatcctg –3’	60	Bme 18I	126;79;39 bp	201;39 bp
IL12	A1188C	5’-ttctatctgatttgcttta –3’ 5’-tgaaacattccatacatcc –3’	43	Taq I	233 bp	165;68 bp	Hall M. A. еt al., 2000

Продолжение таблицы 5

1	2	3	4	5	6	7	8
VDR	B/b	5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’ 5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’	60	Pct I	813 bp	505;308 bp	Wilkinson R.J. et al., 2000
	F/f	5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’ 5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’	60	Fok I	267 bp	197;70 bp
IL1B	+3953 A1/A2	5’-gttgtcatcagactttgacc-3’ 5’-ttcagttcatatggaccaga-3’	58	Taq I	220 bp	148; 72 bp	Wilkinson R.J. et al., 1999
IL1RN	VNTR	5’-tcctggtctgcaggtaa-3’ 5’-ctcagcaacactcctat-3’	60	А1-410 п.о. (4 повтора) А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов) А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов)			Tarlow J.K. et al., 1993