Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика отделяемого влагалища, цервикального канала

Метод диагностики ПЦР позволяет быстро и качественно выявить состав микрофлоры, минуя стадию культивирования и выделения чистых культур бактерий. ПЦР - высокочувствительный метод, позволяющий определить качественный состав микрофлоры, без количественного определения, что не имеет диагностического значения в определении роли того или иного условно-патогенного микроорганизма в возникновении инфекционновоспалительного процесса.

Метод ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Фемофлор», выполняется и автоматически регистрируется специализированным прибором: ДТ-96(ДТ-322), Россия, ООО «НПОДНК- Технология», предусматривает возможность проведения количественной оценки содержания условно-патогенной и нормальной флоры в образце. Программное обеспечение, установленное на указанном оборудовании, автоматически переводит полученные цифровые данные в формат, удобный для трактовки результатов.

Для исследования микроорганизмов урогенитального биотопа у женщин методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Фемофлор» использовали соскобы эпителиальных клеток:

• из влагалища (заднебоковые своды);

• цервикального канала.

Женщины накануне обследования не должны проводить туалет половых органов и спринцевание. Для получения объективного результата необходимо, чтобы исследуемый материал содержал возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи и примеси крови. Неправильное взятие биоматериала может привести к возможности получения недостоверного результата и, вследствие этого, необходимости повторного взятия биоматериала.

Порядок взятия материала в пробирку с транспортной средой.

1. Открыть крышку пробирки;

2. С помощью стерильного одноразового урогенитального зонда

сделать соскоб эпителиальных клеток из соответствующего биотопа (цервикальный канал, влагалище).

3. Перенести зонд с биоматериалом в пробирку с транспортной средой,

зонд тщательно прополоскать в транспортной среде, затем извлечь и выбросить (при необходимости взятия биоматериала из нескольких биотопов, повторить процедуру, каждый раз забирая материал новым зондом в новую пробирку);

4. Пробирку плотно закрыть крышкой, промаркировать.

Перед взятием материала из цервикального канала удаляли ватным тампоном слизь;

зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см;

при извлечении зонда необходимо полностью исключить его

касание стенок влагалища.

Материал из влагалища брали до проведения мануального исследования. Соскоб брали с бокового или заднего нижнего свода влагалища.

Взятый биологический материал маркировали. Материал доставлялся в лабораторию лицами, получившими специальный инструктаж, с учетом правил транспортировки. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию от 2 часов до суток, то пробирку с биоматериалом хранили и доставляли в лабораторию при температуре бытового холодильника (+4^оС), не замораживая. В случае невозможности доставки образца в лабораторию в течение суток, допускается однократное замораживание и хранение образца биоматериала при -20⁰С до 1 месяца.

Набор реагентов «Фемофлор», производства «ДНК-Технология» предусматривает возможность анализа ряда показателей. Необходимым условием количественного анализа урогенитальной микрофлоры является правильная техника взятия соскоба с поверхности соответствующего биотопа (уретра, цервикальный канал, влагалище). Показателем правильного взятия биоматериала является достаточное количество геномной ДНК человека в пробе.

Показатель оценивается в абсолютных значениях. При величине показателя КВМ меньшей, чем 10⁴, результат ПЦР анализа биоты считается недостоверным, что требует повторного взятия биоматериала. Диагностически значимая оценка состояния биоценоза урогенитального тракта заключается в формулировании характеристик различных вариантов: от состояния нормоценоза до состояния выраженного дисбиоза биоты. Нормоценоз. Состояние нормоценоза характеризуется следующими показателями:

1. Общая бакмасса имеет нормальный уровень.

2. Нормофлора (Lactobacillus spp) имеет нормальный уровень (10⁶-10⁸).

3. Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора отсутствует, имеет нормальный уровень, единичные представители УПМ могут иметь слабо увеличенный уровень.

4. Микоплазмы. Mycoplasma hominis и Ureaplasma (Urealiticum + Parvum) Отсутствуют или могут присутствовать в количествах, не имеющих диагностического значения

5. Грибы рода Candida. Сапбіба spp отсутствует или может обнаруживаться в количестве, не имеющем диагностического значения.

Таблица 2.1.

Вариант нормоценоза

Умеренный дисбиоз.

1. Общая бакмасса имеет нормальный уровень.

2. Нормофлора (Lactobacillus spp) имеет умеренно сниженный уровень.

3. Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора: часть условнопатогенной биоты имеет слабо и умеренно повышенный уровень.

4. Микоплазмы: Mycoplasma hominis и Ureaplasma (Urealiticum + Parvum) могут присутствовать в диагностически значимых количествах.

5. Грибы рода Candida: могут присутствовать в диагностически значимых количествах.

Таблица 2.2.

Вариант умеренного дисбиоза

Выраженный дисбиоз.

Таблица 2.3.

Вариант тяжелого дисбиоза

5. Грибы рода Candida: могут присутствовать в диагностически значимых количествах.

Набор реагентов тест-системы «Фемофлор» позволяет определить этиологическую структуру выявленного дисбаланса:

Анаэробный, если дисбаланс вызван анаэробными микроорганизмами: Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp; Atopobium vaginae; Eubacterium spp; Sneathia spp /Leptotrihia spp/Fusobacterium spp; Megasphera spp/Veilonella spp/Dialister spp; Lachnobacterium spp/Clostridium spp; Mobiluncus spp/Corynebacterium spp; Peptostreptococcus spp.

Аэробный, если дисбаланс вызван аэробной микрофлорой: Enterobacteraceae, Streptococcus spp и Staphylococcus spp.

Смешанный, если дисбаланс вызван любым сочетанием аэробной, анаэробной флоры и грибами рода Candida.

Инфекционный процесс, вызванный грибами рода Candida, микоплазмами может протекать без дисбиотических нарушений со стороны условно-патогенной флоры, а также может сочетаться с дисбиозом. Определение этиологической структуры дисбаланса необходимо для решения вопросов, связанных с терапией.

Основными достоинствами полимеразной цепной реакции (ПЦР) являются ее высокая чувствительность и специфичность.

Учитывая малый размер генома микоплазм, специфичность ПЦР зависит, с одной стороны, от специфичности праймеров, с другой - от консервативности ампликона. Одной из характерных черт микоплазм является высокий уровень гетерогенности их генома. В этой связи было предложено использовать праймеры именно к данному участку генома. Другой мишенью, часто используемой при выявлении в пробе Ureaplasma urealyticum является ген уреазы, а для Mycoplasma hominis - ген аргининдезаминазы. Выбор праймеров с разной специфичностью позволяет использовать ПЦР для обнаружения микоплазм.

Известно 2 вида - U.Urealitycum и U.Parvum (ранее биовары). Часто выделяют от больных смешанные культуры различных видов. Виды U.Parvum и U.Urealitycum (ранее биоваров Parvo и Т-960 соответственно) уреаплазм отличаются по вирулентности и строению гена основного фермента - уреазы. Созданы ампликоны, специфичные для определения видов U.Parvum и U.Urealitycum ПЦР позволяет производить

амплификацию определенных последовательностей ДНК. После 25 циклов достигается увеличение в сотни тысяч раз той последовательности ДНК, которая исследуется. Применяя этот метод следует учитывать, что помимо обычных для микробиологических лабораторий предосторожностей, следует принимать меры для предотвращения присутствия даже следов ДНК патогенов, результат зависит и от правильности забора материала, его хранения и транспортировки в лабораторию. Генотипирование культур, накопленных в жидкой питательной среде для индикации урогенитального микоплазмоза проводили с помощью тест-системы Mycoplasma IST2, обеспечивающей культивирование,

идентификацию, количественный учет и определение чувствительности к антибиотикам. В состав набора входят: 25 стрипов (22 теста в каждом), 25 флаконов транспортной среды R1, 25 флаконов лиофилизированного мочевинно-аргининового бульона R1.

Современные ПЦР-системы реального времени (Real-time PCR), тестсистема «Фемофлор», основанные на использовании люминесцентных зондов, позволяют проводить количественные исследования. Эти системы требуют использования специальных амплификаторов с встроенным лазерным спектрофотометром (ДТ-96(ДТ-322), Россия, ООО «НПОДНК-Технология»).

2.5.