Хіміотерапія вірусних інфекцій

Перші антивірусні препарати були отримані з ряду сульфані­ламідних антибіотиків на початку 50-х рр. ХХ ст. синтезом тіосемикарбазонів, ефективних проти поксвірусів. Дію цих препаратів описав Г.

Паралельно досліджували аномальні нуклеозиди. Першим ефек­тивним препаратом із цієї серії став ідоксиуридин (1959). Ідоксиури- дин показав високий ступінь антивірусної активності, але при цьому виявив токсичність, у зв'язку з чим не набув широкого застосування. Значний успіх у хіміотерапії вірусних інфекцій пов'язаний із відкриттям у 1974 р. ацикловіру, ефективного проти герпесвірусів.

Наступним антивірусним препаратом з даного ряду став азидотимідин, який виявляв ефективність проти ВІЛ.

Дев'яності роки ознаменувались відкриттям і розробкою таких антивірусних препаратів, як інтерферони, інгібітори протеаз та антисмислові РНК.

Слід зазначити, що остання декада другого тисячоліття відзначи­лась значним прогресом у розвитку антивірусних препаратів. Для порівняння, за станом на 1990 р. у клінічній практиці проти ВІЛ застосовували лише п'ять антивірусних препаратів, у той час як у 2001 р. кількість антивірусних препаратів зросла майже в сім разів. Станом на 2012 р. у клінічній практиці застосовують близько 50 ан­тивірусних препаратів.

Стадії розробки антивірусних хіміопрепаратів. Процес розробки антивірусного препарату тривалий і складається з кількох стадій:

• ідентифікація мішені та первинні дослідження антивірусної активності сполук різного походження;

• відбір перспективних сполук, їх модифікація та оптимізація;

• доклінічні дослідження;

• клінічні випробування;

• остаточна реєстрація та затвердження препарату.

Загальна схема дослідження антивірусних сполук зображена на рис. 5.5.

Процес створення хіміопрепарату починається з ідентифіка­ції вірусу й супроводжується дослідженням молекулярних механізмів його репродукування, особливостей взаємодії пато­гену з клітиною та організмом.

Клонування, визначення послідовностей, очищення білків і генна інженерія - це методи, за допомогою яких проводять іденти­фікацію генних продуктів, відповідальних за хворобу. Використо­вуючи різні скринінгові стратегії та експериментальні методи, можна дослідити антивірусну активність препарату in vitro.

Рис. 5.5. Схема розробки антивірусних препаратів

Це повторюваний процес, оскільки знайдена активна антиві- русна сполука може бути модифікована й повторно досліджена на простих моделях.

Дослідження антивірусної активності in vitro. Першим ета­пом експериментальної оцінки антивірусної дії сполук природ­ного та синтетичного походження є дослідження їх дії в умовах in vitro. Культура клітин є найбільш зручною моделлю для пер­винної оцінки антивірусної активності препаратів. За допомо­гою цієї системи можна визначити прямий або опосередкований (через клітину) вірусінгібуючий ефект. Дослідження бляшок (детермінація цитопатичного ефекту) є чи не найбільш пошире­ним методом із цієї серії.

З метою встановлення чутливості вірусів до різних препаратів були створені специфічні індикаторні клітинні лінії. Однією з таких ліній є Vero-ICPlO-EGFP, яка була сконструйована шля­хом стабільної трансформації клітин Vero за допомогою плазмі- ди, що кодує GFP (від англ. green fluorescent protein - зелений флуоресціюючий білок). Експресія GFP у даному випадку керу­ється промотором гена ICP10 вірусу простого герпесу другого типу. Важливою перевагою даного методу є швидкість, оскільки вже через 6 год після інокуляції інфіковані клітини стають помі­тними при їх вивченні за допомогою флуоресцентного мікро­скопа. Аналіз за допомогою потокової цитометрії показує, що інтенсивність флуоресценції залежить від титру інокульова­ного вірусу. Таким чином, ця методика забезпечує дослідників швидкою та зручною системою для тестування антивірусної активності різних препаратів.

Застосування культури клітин з метою тестування чутливо­сті вірусів до хіміопрепаратів має певні обмеження. По-перше, різні типи клітин по-різному впливають на розмноження віру­сів. По-друге, для деяких вірусів (наприклад Норволк) не існує відомих культур клітин, у яких вони здатні розмножуватись, і тому при дослідженні активності сполук проти цих вірусів застосовують лабораторних тварин або переважно використо­вують маркери інфекційності. Противірусні препарати, такі як індуктори інтерферону та імуномодулятори, досліджуються на експериментальних моделях in vivo.

Основою досліджень препаратів на культурі клітин є порів­няльна оцінка їх цитотоксичності та антивірусної дії.

Первинні дослідження антивірусної активності сполук часто проводять у безклітинних системах із застосуванням маркерів інфекційності вірусів. У літературі цей підхід отримав назву механізм-опосередкований скринінг. При застосуванні цієї стратегії здійснюється пошук сполук, які можуть інгібувати відомі чи передбачувані специфічні вірускодовані ензими та молекулярні взаємодії. Наприклад, ферменти (протеази, хелікази, нуклеази, полімерази, кінази), активатори транскрипції, рецептори клітинної поверхні та іонні канали є популярними мішенями для механізм-опосередкованого скринінгу антивірусних сполук, оскільки зникнення субстрату чи поява продукту може бути вивчена безпосередньо чи опосередковано.

Прикладом механізм-опосередкованого скринінгу антивірус­них препаратів є пошук речовин, що інгібують вірусоспецифічні протеази (рис. 5.6). Для цього спочатку окремо здійснюють продукування субстрату та протеази за допомогою плазмід на клітинах E. coli. Далі досліджують вплив різних препаратів на активність протеаз in vitro, додаючи можливий інгібітор на одній зі стадій реакції. Наявність білкових компонентів вивчають за допомогою електрофорезу.

Іншим прикладом застосування маркерів інфекційності є клі- тинно-опосередкований скринінг антивірусних препаратів. Даний підхід заснований на пошуку сполук, що інгібують специфічні механізми (вірусні ферменти плюс їх субстрати) у бактеріальних, дріжджових клітинах, клітинах хребетних і безхребетних.

Ці дослідження також проводять на очищених компонен­тах, і далі сполуки можуть бути визначенні як інгібітори після їх застосування на моделі клітини. Як приклад такого підходу можна навести дослідження активності протеази ВІЛ за до­помогою тетрациклінрезистентної генетично модифікованої бактерії. Резистентність до тетрацикліну в E. coli забезпечу­ється спеціальним білком, який виводить антибіотик із кліти­ни. Ідея дослідження полягає в тому, що в білок вбудовується сайт для розщеплення протеазою ВІЛ. Функція білка при цьому не порушується. При коекспресії протеази ВІЛ у кліти­ні E. coli відбувається розщеплення білка і, як наслідок, - втрата клітиною резистентності до антибіотика. Якщо при додаванні в середовище певного препарату клітини залиша­ються резистентними до тетрацикліну, то це є аргументом на користь того, що препарат інгібує активність протеази.

Рис. 5.6. Механізм-опосередковані дослідження активності вірусної протеази

Плазміду використовують для продукування протеази (П) і субстрату (С). Стрілки зверху показують промотор і напрям транскрипції. Кінцеві протеїни позначені праворуч. Аміно- та карбоксикінці кожного пептиду позначені.

При тестуванні інгібуючого чи стимулюючого впливу спо­луки на певну реакцію такі параметри, як зміни клітинного росту, флуоресценції, рН чи іонного складу можуть вивчатися "вручну" або за допомогою чутливої електроніки. Такий під­хід до вивчення антивірусних речовин може забезпечити інформацію не тільки про інгібування певного механізму, а й про цитотоксичність і специфічність препарату, якщо здійс­нювати відповідний контроль.

Завдяки розвитку технологій дослідження структури білків і комп'ютерного моделювання з'явилась можливість підбору антиві­русних сполук, структурно-специфічних до мішені дії (структур- но-опосередкований скринінг). У даному випадку дизайн антиві- русних сполук на основі структури залежить від знання атомної структури молекули-мішені, яка зазвичай вивчається за допомогою рентгеноструктурної кристалографії. Комп'ютерні програми, відомі й передбачувані механізми дії ферментів, фундаментальна хімія відіграють важливу роль при дослідженні лігандів, що будуть зв'я­зуватися з активним сайтом ферменту чи іншим важливим сайтом молекули-мішені та блокувати його активність. Нині вивчена атомна структура більш ніж 6000 макромолекул, включаючи важ­ливі вірусні протеїни. Нижче описано приклад структурно- опосередкованого скринінгу (рис. 5.7), у результаті якого знайдено нові інгібітори СЗ-протеази ріновірусів. Іншим прикладом такого підходу до створення антивірусних препаратів є інгібітори протеа­зи ВІЛ. Інгібітори протеази ВІЛ є чи не найбільш активними анти- вірусними агентами, створеними та покращеними за допомогою структурно-опосередкованого аналізу.

Рис. 5.7. Взаємодія інгібітору із СЗ-протеазою ріновірусу людини другого серотипу

Після встановлення остаточної формули сполуки (сполука має бути водорозчинною) її досліджують на моделях тварин для встановлення різних фармакологічних параметрів, включаючи токсичність і метаболізм.

Дослідження антивірусної активності на лабораторних тваринах. Наступним етапом дослідження сполуки, яка виявила антивірусні властивості в культурі клітин, є її експериментальна оцінка при вірусних інфекціях у тварин. Слід зауважити, що далеко не завжди існує кореляція між вірусінгібуючою акти­вністю сполуки в культурі клітин і в дослідах на тваринах. Відсутність такої кореляції може бути зумовлена не тільки хімі­чною структурою речовини, а й патогенетичними особливостя­ми вірусної інфекції, що моделюється. Проте дослідження конк­ретної експериментальної моделі на лабораторних тваринах дає цінну інформацію про антивірусну ефективність препарату, що вивчається.

Серед факторів, важливих для правильного моделювання вірусної інфекції, суттєвими є такі:

• адекватність експериментальної моделі існуючому захво­рюванню людини;

• шлях інфікування тварини зазвичай відрізняється від при­родного для людини, що вносить корективи в процес перебігу хвороби;

• більшість вірусних інфекцій моделюються на тваринах різних видів, чутливість яких до різних вірусних інфекцій не однакова;

• значну роль у моделюванні вірусної інфекції відіграють штамові особливості вірусу;

• велике значення для оцінки достовірності результатів випро­бувань має однорідність віку, маси й генотипу піддослідних тварин;

• наявність латентної інфекції, викликаної герпесвірусами, аденовірусами, ретровірусами може значною мірою впливати на результати досліджень.

Перелік моделей експериментальних інфекцій, спричинених вірусами, які відіграють важливу роль у патології людини, досить великий, і вони випробовуються на тваринах різних видів: гризунах, птахах, морських свинках, людиноподібних мавпах.

У моделях, що випробовуються на лабораторних тваринах, критеріями оцінки ефективності препарату є ступінь захисту (%), середня ефективна доза ЕД₅₀ за показником виживання, середня тривалість життя тварин та ХТІ. ЕД₅₀ - це величина добової дози препарату (мг/ОД), яка забезпечує захист 50 % тва­рин. Середня тривалість життя відображає динаміку виживання й виражається в днях. Показник ХТІ чисельно виражається відношенням ЛД₅₀ до ЕД₅₀.

Клінічні дослідження антивірусних препаратів. Клінічні випробування - це наукові випробування за участю людей, які проводяться з метою оцінки ефективності та безпеки нового лікарського засобу або розширення показань до застосування вже відомого препарату. Клінічні випробування в усьому світі є невід'ємним етапом розробки препаратів, який передує його реєстрації та широкому використанню. Під час клінічних випробувань отримують інформацію про ефективність і безпеч­ність препарату. У процесі розробки нового препарату обійтись без клінічних досліджень неможливо, оскільки екстраполяція результатів досліджень із застосуванням тварин на людину вірна лише загалом. Наприклад, фармакокінетика препаратів у люди­ни відрізняється від такої в приматів. Клінічні випробування можуть бути ініційовані лише тоді, коли отримані обнадійливі результати під час доклінічних досліджень.

У наш час клінічні дослідження регламентуються Хельсинською декларацією та складаються з чотирьох фаз.

Перша фаза - визначення безпечної дози та способу введен­ня нового препарату, вивчення фармакокінетики та фармакоди- наміки лікарського засобу. До досліджень першої фази зазвичай залучають невелику кількість пацієнтів, інколи не більше десят­ка. Дослідження проводять на здорових волонтерах, ризик яких дуже високо оплачується.

Друга фаза - продовження досліджень безпеки препарату та оцінка його ефективності. Залучають волонтерів, інфікованих зазначеним вірусом, як мінімум дві групи пацієнтів - з препара­том і плацебо.

Третя фаза - порівняння ефективності нового препарату з існуючим стандартом. Зазвичай учасників довільно розподіля­ють до контрольної та дослідної груп. До досліджень третьої фази часто залучають велику кількість пацієнтів. Підбираються дозування та схеми застосування препарату, проводиться його реєстрація.

Четверта фаза - продовження досліджень препарату після його первинного затвердження регуляторними органами. Під час цієї фази основну увагу приділяють подальшій оцінці застосування нового засобу порівняно з іншими загальновжи­ваними препаратами або в комбінації з ними задля отримання більшої кількості даних з безпеки. Дослідження четвертої фази є важливим інструментом для глибшого розуміння при­роди препарату й надання рекомендацій лікарям і пацієнтам з безпечного застосування лікарського засобу при різноманіт­них клінічних станах.

Загалом вартість появи нового препарату у продажу стано­вить близько 1 млрд доларів. За допомогою сучасних методів виявляють тисячі перспективних сполук, проте лише одиниці згодом залучають для антивірусного дослідження в клінічних умовах (рис. 5.8). Дослідження та ідентифікація перспективних сполук є лише початком процесу продукування антивірусних препаратів. Подальша розробка антивірусного препарату вклю­чає: тестування токсичності, модифікацію хімічної формули, формулювання, вивчення фармакокінетики та клінічну апроба­цію. Навіть при застосуванні найсучасніших технологій зазви­чай цей процес триває п'ять - десять років після первинного ви­явлення перспективних сполук.

Рис. 5.8. Діаграма ступінчатого процесу розробки антивірусних препаратів

332

Головною проблемою при розробці як вакцин, так і антивіру- сних препаратів є безпечність даних продуктів для здоров'я лю­дини. Токсичність у культурах клітин і токсичність для тварин є першою ознакою того, що препарат може бути небезпечним. Багато перспективних сполук відкидаються з причини їх токси­чності швидше, ніж з інших причин. У найпростіших випадках сполука має бути токсичнішою для вірусу, ніж для клітини (хазяїна). Цей параметр визначається як цитотоксичний (для клітини) або терапевтичний індекс (для хазяїна). Оцінка токсич­ності та ефективності може бути ускладненою, оскільки багато перспективних сполук нерозчинні у воді. Фармакологія й токси­кологія препаратів має бути остаточно встановлена на різних видах тварин, включаючи приматів, оскільки випробування на людях можна проводити тільки після ретельної апробації на різних видах тварин. Препарати, які можуть застосовуватись для тривалого лікування персистентних інфекцій, не повинні мати хронічної токсичності, алергічних ефектів, мутагенного, терато­генного й карциногенного ефектів. Багато препаратів будуть призначатись дітям, вагітним жінкам чи особам зі зниженим імунним статусом, а це зумовлює додаткові проблеми. У біль­шості випадків безпечність стає важливішою за ефективність. З іншого боку, коли не має ефективних засобів лікування, як у випадку ранньої ВІЛ-інфекції, на людях можуть випробовува­тись навіть препарати, що викликають небажані побічні ефекти (зидовудин).

5.3.