Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

Впервые интерес к использованию костного мозга в терапевтических це­лях появился во время Второй мировой войны, когда Rekers et al. b1939-1940 гг. в Нью-Йорке проводили эксперименты по внутривенному введению костно­го мозга здоровых собак собакам, подвергшимся облучению в 350 рентген.

10 лет были опубликованы важнейшие с точки зрения понимания процесса трансплантации исследовательские работы по удачной пересадке клеток се­лезенки здоровых мышей (Jacobson et al., 1949) и клеток костного мозга (Lo­renz et al., 1951) мышам, получившим летальную дозу облучения. В этих ра­ботах была доказана протективная роль клеток костного мозга, после чего постепенно пришло понимание того, что TKM может применяться для лече­ния таких состояний, как приобретенная аплазия костного мозга, лейкемия и др. Первая успешная TKM больному с терминальной стадией гемобластоза от здорового близнеца была произведена D. Thomas et al. в 1959 г. Также в кон­це 50-х гг. была впервые проведена трансплантация аутологичного заморо­женного костного мозга — аутотрансплантация. В 80-х - 90-х гг. на моделях опухолей человека активно изучалась зависимость индуцированной цито­токсичности и апоптоза от доз и экспозиции различных химиопрепаратов. Оказалось, что такие алкилирующие агенты, как мелфалаи, тиотепа, нитрозо­мочевина обладают выраженным антипролиферативным потенциалом при минимальном увеличении концентрации их в крови. Эти и подобные препа­раты стали впоследствии применяться в режимах кондиционирования для максимальной эрадикации опухоли.

Таким образом, начиная с середины XX в. происходило формирование двух основных понятий, касающихся пересадки клеток костного мозга: алло­генная трансплантация — замена собственного костного мозга донорским, и аутологичная трансплантация — введение собственного костного мозга с це­лью преодоления потенциальной летальной гематологической токсичности XT/радиотерапии.

В настоящее время ТГСК от доноров является родом профессиональной медицинской деятельности, распространенной по всему миру и объединяю­щей огромное количество специалистов. Самыми крупными международны­ми профессиональными сообществами по трансплантации стволовых кле­ток на текущий момент являются:

■ Европейская ассоциация по трансплантации крови и костного мозга (EBMT);

■ Международный исследовательский центр в области трансплантации крови и костного мозга (CIBMTR);

■ Азиатская тихоокеанская организация по трансплантации крови и костного мозга (APBMT).

Кроме того, существует множество национальных групп, занимающих­ся ТГСК в различных развитых странах (Австрия, Чехия, Франция, Германия, Италия, Нидерланды, Испания, Швейцария, Турция, Великобритания, Австра­лия, Канада, Япония, Новая Зеландия, Северная Америка).

Процесс аллогенной трансплантации (костного мозга, периферических стволовых клеток (ИСК), пуповинной крови, различных клеточных субпопу­ляций) абсолютно невозможен без программы привлечения доноров. В мире процесс рекрутинга потенциальных добровольных доноров, их обследова­

ние, хранение информации, связанной с донорством, наблюдение за донора­ми в отдаленном периоде осуществляется Международной ассоциацией до­норов костного мозга (WMDA). Данная организация постоянно обновляет стандарты и руководства по работе с добровольными донорами ГСК по все­му миру. Для максимально быстрого поиска HLA-совместимых неродствен­ных доноров для конкретных пациентов все донорские регистры пересы­лают данные по HLA-типированию в BMDW C 1997 г в США функционирует Международная ассоциация NETCORD, занимающаяся сбором и хранением пуповинной крови как источника ГСК для трансплантации.

Участие России в работе указанных международных организаций, к со­жалению, практически отсутствует; также отсутствует собственный феде­ральный донорский регистр.

Восстановление кроветворения после пересадки ГСК возможно благодаря их способности к постоянному делению, самообновлению и созданию фун­кционального потомства высоко специализированных клеток. Работа по из­учению и выделению ГСК из костного мозга была начата в 1960-х гг. Till и Mc­Culloch. В настоящее время в качестве источников ГСК для трансплантации используют костный мозг, периферическую кровь или пуповинную кровь. Иммунофенотипически ГСК выглядят следующим образом: Lin-CD34⁺CD38- c-kit CDl33 они составляют ±0,1 % клеток костного мозга. Для нормального функционирования ГСК в течение жизни человека очень важно микроокру­жение этих клеток (у взрослого человека — остеобласты костных трабекул), которое обеспечивает различные рецептор-лигандные взаимодействия мо­лекул адгезии, цитокинов и хемокинов, необходимые для самообновления стволовых клеток.

Увеличить процент ГСК в костном мозге и вызвать выброс их в перифе­рическую кровь возможно благодаря применению колониестимулирующих факторов. Предварительная стимуляция доноров колониестимулирующих факторов необходима в случае использования для ТГСК периферической крови. Режимы стимуляции разработаны таким образом, чтобы сбор у доно­ра осуществлялся на пике выброса ГСК в периферическую кровь.

(чаще у взрослых) или центральные (чаще у детей) вены. Современные не­прерывно-поточные сепараторы и разработанные методики по заполнению контура кровезамещающими растворами или эритроци гарной взвесью по­зволяют осуществлять сбор ГСК периферической крови даже у детей весом 10-12 кг. На практике наиболее быстрое восстановление кроветворения у па­циентов происходит после трансплантации стимулированных колониести­мулирующих факторов ГСК периферической крови и костного мозга, суще­ственно медленнее — после пересадки нестимулированного костного мозга или образцов пуповинной крови. Выбор источника ГСК для трансплантации определяется в каждом конкретном случае такими факторами, как возраст и вес донора и реципиента, возможность проведения эксфузии костного мозга (в случае аутотрансплантаций у пациентов с опухолями костей таза или по­сле облучения костей таза), опыт конкретных трансплантационных центров.

Аллогенная ТГСК и ВДХТ с ауто-ТГСК включены во множество современ­ных протоколов лечения онкологических заболеваний; активно ТГСК вне­дряется в протоколы лечения неонкологических заболеваний (аутоиммун­ные заболевания, врожденные метаболические заболевания, AL амилоидоз). В Европе в настоящее время проводится около 10 000 аутотрансплантаций и 15 000 аллогенных трансплантаций в год. По данным 605 трансплантаци­онных команд Европы, приведенным в табл. 5.3, можно приблизительно оце­нить, при каких заболеваниях применяется алло-ТГСК и ВДХТ с ауто-ТГСК.

Таким образом, роль аллогенной ТГСК наиболее важна при гемобластозах у взрослых и детей, особенно при генетических мутациях на уровне очень ран­них гемопоэтических предшественников и дефектах микроокружения (мие- лодиспластический синдром/миелопролиферативное заболевание, миелоди- спластический синдром/лимфопролиферативное заболевание, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз), когда применение ВДХТ невозможно и собст­венный костный мозг заменяется донорским.

Показания кТГСК классифицируются следующим образом: состояния, при которых ТГСК является «золотым стандартом» (алло-ТГСК при ОМЛ во второй ремиссии), опциональным методом лечения (алло-ТГСК при НХЛ), развиваю­щимся методом (ауто-ТГСК при аутоиммунных заболеваниях), не рекоменду­ется (бластный криз при ХМЛ).

Процесс аллогенной ТГСК начинается с определения показаний, выбо­ра донора и источника стволовых клеток. Донор может быть родственным и неродственным, полностью или частично HLA-совместимым. Стандартным источником ГСК для алло-ТГСК является родственный HLA-совместимый до­нор, альтернативными источниками — совместимые неродственные доноры, частично совместимые родственные и неродственные доноры, ГСК пуповин­ной крови. Хотя данные HLA-типирования классически являлись ключевым

Таблица 53. Количество и диагнозы пациентов, которым впервые проводилась трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, по данным 605 трансплантационных центров Европы, 2006 г.

критерием выбора донора и основным фактором исхода алло-ТГСК, в послед­нее время все чаще появляются работы, в которых показано превосходство результатов трансплантаций от альтернативных доноров для пациентов с онкологическими заболеваниями крайне неблагоприятного прогноза по по­казателю безрецидивной и бессобытийной выживаемости. Связано это с по­ниманием основной задачи аллогенной ТГСК — развития противоопухолево­

го эффекта донорских иммунокомпетентных клеток (эффект «трансплантат против опухоли»). Впервые указанный эффект был описан на животных в 1957 г. (Barnes и Loutid), а позже показан при успешном лечении рецидива XMJl после аллогенной ТГСК путем дополнительных трансфузий донорских лимфоцитов.

Итак, в настоящее время в отсутствие совместимого родственного донора выбор альтернативого источника ГСК осуществляется в индивидуальном по­рядке. Донор проходит стандартное обследование, включающее осмотр, обще­клинические лабораторные и функциональные обследования, серологическое обследование на ВИЧ, сифилис, гепатиты, цитомегаловирусную инфекцию. Как только донор дает согласие на процедуру сбора ГСК и признается годным для донорства, пациента начинают готовить к трансплантации. Режимы кон­диционирования — это схемы химио-, лучевой, иммунотерапии, проводимые реципиентам перед пересадкой ГСК; основные задачи проводимых режимов кондиционирования: создание подходящей ниши для приживления переса­живаемых клеток, иммуносупрессия для предотвращения отторжения тран­сплантата и эрадикация остаточной болезни. Основное разделение режимов кондиционирования перед аллогенной трансплантацией проводится по прин­ципу миелотоксичности: миелоаблативные режимы и немиелоаблативные ре­жимы. Основные различия между режимами представлены в табл. 5.4.

Таблица 5.4. Характеристика режимов кондиционирования

Как видно из табл. 5.4, истинно немиелоаблативный режим (малый) пол­ностью не подавляет собственный гемопоэз реципиента, лишь обеспечива­ет иммуносупрессию, достаточную для постепенного полного или частич­ного приживления донорских ГСК. В случае неприживления трансплантата собственное кроветворение, как правило, восстанавливается в течение меся­ца. Режим со сниженной интенсивностью, занимая промежуточную позицию между миелоаблативным и истинно немиелоаблативным режимом, обеспе­чивает иммуносупрессию, как правило, достаточную для полного быстрого приживления донорских ГСК. В случае неприживления трансплантата у па-

циепта наблюдается длительная аплазия костного мозга. Обычно в состав режима кондиционирования входят миелотоксические агенты (бусульфан, мелфалан, нитрозомочевина) и химиопрепараты с иммуноаблативной на­правленностью (флюдарабин, циклофосфамид). В случае проведения ТГСК из альтернативных источников добавляется антитимоцитарный глобулин для профилактики иммунологического отторжения трансплантата. Сниже­ние интенсивности режимов кондиционирования позволяет расширить по­казания к аллогенной ТГСК у больных с инфекционной и органной патоло­гией, при проведении повторных трансплантаций, т. е. в тех случаях, когда проведение стандартных миелоаблативных режимов связано с высоким про­центом трансплантационной летальности. В педиатрической практике ис­пользование режимов кондиционирования со сниженной интенсивностью позволяет надеяться на уменьшение отдаленных последствий XT, таких как замедление роста, катаракта, дисфункции эндокринных желез, нарушения фертильности вплоть до стерильности. Выбор режима кондиционирования производится согласно протоколам, имеющимся в конкретном транспланта­ционном центре, для различных заболеваний.

За время проведения пациенту режима кондиционирования происходит стимуляция кроветворения у донора. В день трансплантации у донора про­изводится сбор ГСК, после чего материал переливается реципиенту в цен­тральную вену. Существует несколько способов «очистки» трансплантата от находящихся в нем зрелых Т-лимфоцитов, отвечающих за развитие у паци­ента в посттрансплантационном периоде РТПХ: функциональная деплеция, иммуно-магнитная СПЗ⁺СЫ9⁺-деплеция, иммуно-магнитная CD34⁺CD133⁺- селекция. Последние 2 метода производятся на специальных колонках. На практике показано, что пороговым значением для развития РТПХ является 0,5-1 ? 10' CD3 кл./кг веса реципиента. При трансплантации дозы Т-клеток, меньшей пороговой, практически отпадает необходимость профилактики острой РТПХ. Частичное удаление иммунокомпетентных клеток из тран­сплантата имеет и свои отрицательные стороны: замедленное восстановле­ние иммунитета и, как следствие, увеличение частоты и тяжести инфекций, повышение вероятности недостаточности трансплантата, отторжения тран­сплантата и рецидивов заболеваний. Данные факты, наряду с развитием эф­фективных механизмов профилактики острой РТПХ, заставляют многих ис­следователей в последнее время отказываться от недифференцированной деплеции иммунокомпетентных клеток.

Ранним посттрансплантационным периодом условно назван период первых 100 дней после ТГСК. В это время в идеале происходитустановление донорского кроветворения; для пациента это самый критичный период трансплантации, когда он переживает органную токсичность режима кондиционирования, ин­фекционные осложнения во время аплазии костного мозга, развитие острой РТПХ (если происходит), проблемы, связанные со стремительным восстанов­лением («синдром приживления трансплантата», «engraftment syndrome»), или, наоборот, с недостаточностью трансплантата или иммунологическим оттор­

жением, специфические для трансплантационных пациентов осложнения (ве­но-окклюзионная болезнь печени, идиопатическая пневмония, диффузный альвеолярный геморраж, синдром капиллярной утечки, синдром полиорган- ной недостаточности). Поэтому еще до снижения лейкоцитов пациенты начи­нают получать целый комплекс профилактических мероприятий: деконтами­нацию кишечника, медикаментозную профилактику грибковых и вирусных инфекций, вено-окклюзионной болезни печени, санацию полости рта. Назна­чение антибиотиков производится согласно алгоритму, принятому в центре, для пациентов в состоянии фебрильной нейтропении. Профилактика острой РТПХ начинается со дня, предшествующего трансплантации, и включает, как правило, комбинацию ингибитора кальциневрина (циклоспорин А, такроли- мус) и низких доз метотрексата.

После стойкого восстановления кроветворения начинается мониторинг посттрансплантационного химеризма, т. е. соотношения элементов донор­ского и собственного кроветворения у реципиента. Существуют термины: полный донорский химеризм (т. е. 100% ядерных клеток крови реципиента имеют происхождение из костного мозга донора) и смешанный химеризм (одновременное присутствие у реципиента элементов собственного и донор­ского кроветворения). Химеризм оценивается с помощью ПЦР-методики, вы­являющей специфические ДНК-последовательности (различные у донора и реципиента) — VNTR (локусы с варьирующим числом тандемных повторов) и STR (локусы с короткими тандемными повторами). Чувствительность метода составляет 1 ? 10^ς. Анализ химеризма в режиме реального времени помогает вовремя определить начавшееся отторжение трансплантата и принять меры к сдвигу химеризма в сторону донорского.

РТПХ является одним из основных осложнений аллогенной транспланта­ции, связанных с действием иммунокомпетентных клеток донора, содержа­щихся в трансплантате, на органы и ткани реципиента. РТПХ может иметь 2 клинических типа течения: острое и хроническое. У некоторых пациентов клинические признаки острой и хронической РТПХ могут развиваться од­новременно («overlap syndrome»). В табл. 5.5 представлена современная клас-

Таблица 5-5. Классификация реакций «трансплантат против хозяина» Национального института здоровья США

сификация РТПХ, предложенная на Согласительной конференции Нацио­нального института здоровья США.

Основными органами-мишенями, по которым осуществляется градация острой РТПХ, являются кожа, кишечник и печень. Вовлекаются в процесс так­же эпителий конъюнктив, мочевого пузыря, трахеобронхиального дерева, экзо­кринные железы. Реже могут поражаться и другие органы и системы с возникно­вением миокардита, полисерозита, пульмонита, орхита, энцефалита и т. п.

В табл. 5.6 представлены данные EBMT WP-PD (Рабочая группа по детским заболеваниям в рамках EBMT) и IBFM SG-BMT (Международная группа иссле­дователей по TKM в рамках BFM) по применению схем лечения острой РТПХ, основанных на классификации по степени тяжести состояния больного.

Таблица 5.6. Основные схемы лечения острой реакции «трансплантат против хозяина»

Развитие хронической РТПХ может происходить путем прогрессирова­ния острой РТПХ и трансформации ее в хроническую, а может возникать de novo.В отличие от острой РТПХ хроническая РТПХ имеет множество мани­фестаций и может поражать большое разнообразие органов и систем. Наи­более часто клиническими признаками хронической РТПХ являются лихе­ноидные изменения, сухость, склероз кожи, ротовой полости (ксеростомия), глаз (ксерофтальмия), влагалища, пищевода, печени, легких (облитериру­ющий бронхиолит), фасциит, поражение серозных оболочек и, реже, почек (по типу нефротического синдрома). В целом, для хронической РТПХ в отли­чие от острой наиболее характерными являются склеротические изменения органов. Терапия хронической РТПХ включает применение лекарственных средств местного и системного действия. Разнообразие средств местного применения включает: растворы с дексаметазоном для полоскания полости рта, контактные линзы для больных с синдромом «сухого глаза», топические

препараты стероидов и такролимуса для наружного применения. При рас­пространенных или локализованных прогрессивно ухудшающихся формах хронической РТПХ необходимо применение средств системного действия. В лечении хронической РТПХ основными препаратами остаются стероид­ные гормоны, обычно назначаемые первично в дозе 1 мг/кг/сут. В случае рези­стентного к стероидам течения хронической РТПХ необходимо назначение терапии второй линии (микофенолат мофетил, сиролимус, такролимус, та­лидомид, делагил, пентостатин, ритуксимаб, экстракорпоральный фотофе- рез). Назначение того или иного лечения зависит от опыта и возможностей конкретного трансплантационного центра.

Очень важным событием после трансплантации является момент выпи­ски пациента из стационара для наблюдения по месту жительства. Если го­ворить о детях, на этом этапе выживаемость детей-реципиентов аллогенных ГСК во многом зависит от умения родителей (родственников) и врачей обра­щать внимание на изменения состояния ребенка, способности и желания кон­тактировать с трансплантационным центром при возникновении вопросов и проблем, а также от своевременного обеспечения на местах жизненно необ­ходимыми препаратами (иммуносупрессивными, антибактериальными, про­тивовирусными, противогрибковыми, иммуноглобулинами и др). Врачи, ле­чащие реципиента аллогеных ГСК на местах, должны быть осведомлены о первых признаках обострения РТПХ (появление сыпи и зуда кожи, учащение и послабление стула, повышение эозинофилии в периферической крови, уве­личение печеночных трансаминаз). Кроме того, следует помнить том, что па­циенты после аллогенной ТГСК, особенно получающие иммуносупрессивные препараты, находятся в постоянном клеточно-гуморальном иммунодефици­те (1—2 года после полной отмены иммуносупрессии), и, следовательно, более других подвержены различного рода инфекциям, которые могут принимать у них угрожающе стремительное течение. Подобно пациентам с другими вида­ми иммунодефицитов, у пациентов после аллогенной ТГСК даже в позднем по­сттрансплантационном периоде (> 100 дней) встречаются такие специфиче­ские состояния, как пневмококковые и пневмоцистные пневмонии, кандидоз слизистых, аспергиллез легких, придаточных пазух носа, цитомегаловиру­сная инфекция (с поражением легких, печени, кишечника, слизистой мочево­го пузыря), герпес-зостер, криптококковый менингит и т. п. При подозрении на инвазивную инфекцию такие пациенты должны быть госпитализированы в изолированную палату, пристально обследованы; антимикробное лечение по современным алгоритмам должно быть начато незамедлительно.

Чаще других в отдаленном периоде (1-5 лет) аллогенной ТГСК дети нужда­ются в наблюдении следующих специалистов: эндокринолог (контроль за со­стоянием щитовидной железы, кальциево-фосфорным обменом, половым созреванием, ростом), офтальмолог (РТПХ глаз), ортопед (остеопении, асеп­тические некрозы костей), педиатр (наблюдение за общим состоянием, выяв­ление проблем, своевременная вакцинация по специальному календарю). По­нимание этими специалистами основных аспектов аллогенной ТГСК может

способствовать улучшению качества жизни данных пациентов и увеличению бессобытийной выживаемости.

У детей ВДХТ с трансплантацией аутологичных ГСК является, как прави­ло, консолидирующим этапом лечения онкологических заболеваний, чувст­вительных к XT Обычно ВДХТ включается в протоколы лечения опухолей не­благоприятного прогноза (высокого риска). Современные представления о роли ВДХТ с ауто-ТГСК в лечении онкологических заболеваний у детей отра­жены в табл. 5.7.

Таблица 5.7. Роль высокодозной химиотерапии с аутотрансплантацией гемопоэтических стволовых клеток в лечении детей с онкологическими заболеваниями

Сбор ГСК производится на ранних этапах лечения при условии очистки костного мозга от опухоли (в случае первичного поражения) либо из задних гребней подвздошных костей (10-15 мл костного мозга/кг массы тела реци­пиента), либо из периферической крови после предшествующей стимуляции Г-КСФ. Минимальная доза CD34⁺, достаточная для нормального восстановле­ния лейкоцитов, составляет 2 ? 10⁶∕κr массы реципиента; оптимальной дозой для быстрого восстановления лейкоцитов и тромбоцитов является CD 34⁺ 5-6 ? 10⁶∕κr. Сборы ПСК можно производить повторно до получения необхо­димого количества ГСК. Существуют методики исследования и очистки тран­сплантата от опухолевых клеток.

После сбора производится криоконсервация трансплантата по разрабо­танным в каждом конкретном криобанке методикам до момента готовности пациента к аутотрансплантации. В день трансплантации материал быстро размораживается на водяной бане (37-38 ⁰C) и быстро переливается пациен­ту в центральную вену. Побочные явления после введения клеток (гемогло­

бинурия, тошнота, боли в животе и др.) связаны с присутствием в материале криоконсерванта (высокоочищенный диметилсульфоксид) и индивидуаль­ной чувствительностью к нему пациента.

Средняя длительность аплазии костного мозга у пациентов после ВДХТ с ауто-ТГСК составляет 12-16 дней в зависимости от клеточности переливае­мого материала. Отстрочить приживление может присоединение вирусных инфекций (CMV, Parvovirus, Varicella zoster virus. Adenovirusи др). В целом, тяжесть состояния пациентов после ВДХТ зависит от развития органной токсично­сти и присоединения инфекций. Высокодозная XT с ауто-ТГСК, так же как и аллогенная ТГСК, должна проводиться в отдельном подразделении специа­лизированного центра с высокой степенью изоляции пациентов (отдельные боксы с НЕРА-фильтрами, желательно с ламинарным потоком воздуха).

Аллогенная ТГСК и ВДХТ с ауто-ТГСК в настоящее время являются рутин­ными процедурами, позволяющими существенно повышать выживаемость пациентов с целым рядом онкологических и неонкологических заболеваний. Новые разработки в вопросах ТГСК заключаются в основном в более четком вычленении групп пациентов, нуждающихся в данном методе лечения, усо­вершенствовании протоколов сопроводительной терапии после аллогенных трансплантаций. Для России крайне важным является повышение знаний о ТГСК, ее необходимости и последствиях среди врачей в регионах.

Наряду с постройкой новых трансплантационных центров, создание соб­ственного банка ГСК, расширение лабораторной базы (с возможностью ру­тинного проведения молекулярно-генетических, фармакокинетических и других исследований) позволит обеспечить существенно большее количест­во пациентов необходимым им лечением (ТГСК) и снизить затраты на поиск донора и оплату трансплантации за рубежом.