Определение активности эритроцитарной супероксиддисмутазы

Принцип метода основан на ингибировании кинетики образования формазана при восстановлении нитросинего тетразолия супероксидным радикалом, генерируемым в системе ксантин-ксантиоксидаза [114].

Оборудование: спектрофотометр SPECORD 205 с программным обеспечением WinAspect (версия 2.1.1.0) с термостатируемым блоком Пельтье и магнитной мешалкой, набор акриловых кювет, лабораторная посуда, центрифуга с охлаждением.

Ход определения: в акриловую кювету вносили 1950 мкл реакционной смеси и такое количество раствора ксантиноксидазы, чтобы скорость изменения оптической плотности при 560 нм составляла 0,016-0,018 ед/мин. Скорость ксантиоксидазной реакции замеряли в течение 1 минуты. При измерении активности супероксиддисмутазы (СОД) в кювету с реакционной смесью последовательно вносили несколько аликвот разведенного супернатанта, измеряя скорость восстановления нитросинего тетразолия для каждой аликвоты в течение 1 минуты. Строили калибровочную прямую зависимости процента ингибирования начальной скорости восстановления нитросинего тетразолия от количества мкл внесенного супернатанта. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления нитросинего тетразолия в условиях проведения реакции. Активность (А₅бо) СОД рассчитывали по формуле:

_ VppXRxR ⁵⁶⁰ I50 X Co/_oHb

Где V_pc - объем реакционной смеси;

К - коэффициент разбавления лизата эритроцитов;

R - величина разведения супернатанта;

1₅₀ - количество разведенного супернатанта, необходимое для 50% ингибирования кинетики реакции;

Со/онь ~ концентрация гемоглобина в отмытых эритроцитах.

Активность СОД отражает функциональное состояние основного ферментативного пула первой линии антирадикальной защиты. В нашем исследовании её выражали в единицах активности на миллиграмм гемоглобина (ед/мг НЬ).

2.4.5.2.