Методические рекомендации по определению ферментативной активности бактерий

Утверждены ГУВ МСХ и П РБ 03.03.2008 (№ 10-1-5/130)

Методические рекомендации подготовили: А.Э. Высоцкий, А.П. Лысенко, З.Н. Барановская, И.И. Румачик, И.В. Фомченко, С.А. Иванов, Г.Е.

Общие положения

Настоящие Методические рекомендации определяют порядок определения ферментативной активности бактерий, выделенных из патологического материала, проб кормов, воды, чистых культур и других материалов, для диагностических ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских организаций и высших учебных заведений ветеринарного профиля при диагностике болезней животных (включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел).

Методы выявления сахаролитических свойств

В состав углеводных сред, применяемых для дифференциации бактерий, входят различные соединения: моносахариды, полисахариды, многоатомные спирт. Все перечисленные углеводы в лабораторной практике нередко условно обозначают одним термином — «сахара». Перечень углеводов, которые обычно используют в лабораториях, приведен в таблице 1.

Таблица 1

Углеводы, применяемые в микробиологии

При утилизации углеводов в качестве конечных продуктов образуется ряд кислот, альдегидов, спиртов и газообразных соединений (Н₂, СО₂), что приводит к закислению среды.

Изменение рН питательной среды, содержащей углевод, регистрируется добавлением в нее определенных индикаторов.

Есть индикаторы, приобретающие определенную окраску только в кислой или щелочной среде (одноцветные). Удобны индикаторы, дающие в щелочной и кислой среде разный цвет (таблица 2). Например, лакмусовая настойка при кислых значениях рН имеет розовую, а при щелочных — синюю окраску.

Наиболее часто для регистрации изменения рН питательной среды в результате утилизации субстрата, в частности углеводов, используют следующие индикаторы.

Индикатор Андреде. 1 г кислого фуксина растворяют в 400 мл дистиллированной воды и 64 мл нормального раствора едкого натра, выдерживают сутки при 37°С, 2 суток — на свету. Хранят в склянках темного стекла. В среды Гисса вносят 1% индикатора. Этот индикатор не позволяет улавливать защелочение среды.

Индикатор ВР (водный голубой + розоловая кислота). Меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.

Бромкрезоловый пурпурный. Индикатор — 1,6 г, этанол 96%-ный 100 мл, получается 1,6%-ный спиртовой раствор. В среду Гисса добавляют 0,1% спиртового (1,6%) раствора бромкрезолового пурпурного.

Бромтимоловый синий. Готовят и добавляют в среду в тех же пропорциях, что и бромкрезоловый пурпурный.

Лакмусовая настойка. К 100 мл 96%-ного этанола добавляют 10 г сухого растертого в порошок лакмуса, смесь выдерживают при 37°С три дня. Окрашенную жидкость ежедневно сливают, заменяя новым спиртом. После окончания экстрагирования осадок взбалтывают, смесь фильтруют, осадок высушивают на фильтре, затем снятый с фильтра порошок заливают 100 мл дистиллированной воды, выдерживают при 30° С три дня, сливают настойку с бесцветного осадка, добавляют 0,6 мл хлороформа на каждые 10 мл жидкости и хранят в темноте.

Феноловый красный (1,6%-ный щелочной раствор): феноловый красный — 3,6 г, раствор гидроокиси натрия (0,25N) — 20 мл; вода дистиллированная — 80 мл.

Таблица 2

Цвет некоторых индикаторов в зависимости от рН

Феноловый красный (0,4%-ный водный раствор): феноловый красный — 0,1 г, вода дистиллированная стерильная — 25 мл.

Феноловый красный (0,2%-ный спиртовой раствор): феноловый красный — 0,2 г, этанол 50%-ный — 100 мл.

Среды с углеводами могут быть жидкими или полужидкими. Рецепты плотных дифференциально-диагностических сред с углеводами приведены в соответствующих технических нормативных правовых актах. Плотные среды с углеводами и индикаторами чаще используют при первичных посевах исследуемого материала. К плотным углеводным дифференциально-диагностическим средам относятся агар Эндо, Левина и другие.

Их применение позволяет по факту расщепления углеводного субстрата облегчить бактериологу отбор интересующих колоний из общего числа выросших для дальнейшего изучения. Жидкие и полужидкие углеводные дифференциально-диагностические среды служат для определения ферментативной активности чистых культур бактерий.

Ветеринарные бактериологические лаборатории обычно пользуются полужидкими углеводными средами с индикатором ВР (водный голубой + розовая кислота). Индикаторы для некоторых видов бактерий могут быть токсичными, в таких случаях их добавляют после культивирования по каплям (0,02-0,04%-ный спиртовые растворы).

Обязательным условием для таких сред является отсутствие углеводов в пептоне, нельзя использовать в качестве основы по этой же причине мясную воду. Для определения сахаролитических свойств анаэробов применяют бульон на основе сброженной мясной воды. Для контроля желательно инкубировать одну незасеянную пробирку с углеводом. При оценке кислотообразования следят за временем закисания питательной среды и степенью изменения рН. Изменение рН определяют по цвету индикатора в среде.

Образование газов при утилизации углеводов регистрируют различными способами в зависимости от типа питательной среды и физиологических особенностей бактерий.

При использовании жидких сред с углеводами для улавливания газов в бактериологическую пробирку помещают стеклянный поплавок, который должен быть заполнен средой. Возможны ложноположительные результаты, если до использования такие жидкие среды хранили в холодильнике (при низкой температуре растворимость газов увеличивается, а при нагревании они выделяются и скапливаются в поплавке).

Полужидкие среды с углеводами более удобны для регистрации газообразования: в толще питательной среды в положительных случаях образуются пузырьки газа или разрывы агара.

Среды с углеводами (Гисса) готовят следующим образом. Углеводы добавляют в среду следующего состава: пептон — 10 г, натрия хлорид — 5 г, вода дистиллированная — 1000 мл, 0,1% индикатора Андреде (или других). При изготовлении полужидкой среды добавляют 0,2-0,4% агара.

В дистиллированной воде вначале растворяют навески натрия хлорида и пептона, добавляют индикатор, фильтруют, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 минут при 121°С. Затем в среду добавляют необходимое количество углеводов (глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы — по 1%; адонита, глицерина, сорбита, дульцита, целлобиозы, рафинозы, трегалозы, салицина, арабинозы, мальтозы, рамнозы, ксилозы — по 0,5%) Некоторые углеводы вызывают легкое закисление среды. Поэтому, добавляя по каплям 0,1N раствор гидроокиси натрия, необходимо восстановить исходный цвет среды. Приготовленную среду Гисса разливают в стерильные пробирки по 3-4 мл и стерилизуют при 110°С 30 минут или дробно текучим паром. Готовые среды с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет, бромтимоловым-синим-болотно-зеленый (рН 7,0-7,2).

Ряд углеводов являются термолабильными (дисахариды, ксилоза, рам-ноза, салицин, глицерин, арабиноза) и их предпочтительнее стерилизовать в виде 10%-ных водных растворов фильтрацией или текучим паром два дня по 30 минут, а затем добавлять в нужной концентрации в стерильную питательную среду.

Биологическая промышленность выпускает сухие углеводные среды с индикатором ВР. Состав сред и способ приготовления указаны на этикетке флакона. Готовые среды являются полужидкими.

Бульон для определения сахаролитических свойств анаэробных бактерий на основе сброженной мясной воды готовят по следующему рецепту. К сброженной мясной воде добавляют 2% пептона, углевод (2%), устанавливают рН 7,2-7,4, наслаивают вазелиновое масло, стерилизуют дробно текучим паром три дня подряд.

Микроорганизмы, обладающие повышенными пищевыми потребностями, не могут расти на средах Гисса обычного состава, для их выращивания используют сывороточно-пептонную воду. С этой целью 1 объем стерильной сыворотки смешивают с 3 объемами стерильной 0,1 %-ной пептонной воды. Сыворотку крови предварительно прогревают 1 ч при 60°С для инактивации имеющихся в ней амилазы и мальтазы.

Обогащение сред Гисса ростовыми добавками часто приводит к неоднозначным результатам, т.е. рН среды и поведение индикатора в значительной степени подвержены действию метаболитов, образующихся при расщеплении иных веществ, чем известный углеводный субстрат. В определенной степени этого явления удается избежать при использовании следующего метода выявления сахаролитических свойств бактерий.

Быстрый тест на утилизацию сахаров

Рекомендуется для определения сахаролитических свойств у бактерий, требовательных к питательным средам.

В стерильную пробирку вносят 0,1 мл солевого буферного раствора или жидкой среды и добавляют каплю раствора углевода. Контроль — в пробирку вместо углевода вносят каплю дистиллированной воды. Затем в обе пробирки вносят каплю густой взвеси 18-24-часовой агаровой культуры в солевом буферном растворе или одну полную петлю просто бактериальной массы. Пробирки инкубируют в водяной бане при 35°С в течение четырех часов, результат учитывают каждые 30 минут. Положительный результат — пожелтение среды (закисление).

Приготовление солевого буферного раствора: фосфорнокислый калий двузамещенный (безводный) — 0,04 г, фосфорнокислый калий однозаме-щенный — 0,01 г, хлористый калий — 0,8 г, феноловый красный (1%-ный водный раствор) — 0,4 мл, дистиллированная вода (рН 7,0) — 100 мл, стерилизуют фильтрованием и хранят при 4°С.

Приготовление растворов углеводов: в дистиллированной воде или жидкой среде (пептон — 1 г, мясной экстракт — 3 г, натрия хлорид — 5 г, дистиллированная вода — до 1000 мл) готовят 20%-ный раствор углевода, устанавливают рН 7,0, стерилизуют фильтрованием.

Близкий методический подход по тестированию сахаролитических свойств бактерий реализуется при использовании комбинированных систем определения ферментативной активности (ПБДЭ, СИБ и т.д.). При определении сахаролитических свойств у анаэробов, когда внесение индикатора в среду с углеводами нежелательно (токсичность, разрушение индикатора в процессе роста), его вносят после культивирования по каплям или определяют рН при помощи рН-метра, используя тонкий электрод, который входит в пробирку.

Если сахаролитические свойства у анаэробов определяют в предварительно восстановленном пептонно-дрожжевом бульоне, то учитывают, что пропускание через среду СО₂ снижает рН до 6,2-6,4. Поэтому как показатель слабого подкисления принимают уровень рН 5,5-6,0, сильного – рН ниже 5,5. Если в состав среды входят входили арабиноза, рибоза или ксилоза, то значение рН среды 5,7 или ниже означает подкисление. В таких опытах всегда в качестве контроля необходимо определять рН в бульоне без углеводов, так как иногда кислота может образоваться из пептонов.

Обнаружение газообразования при расщеплении углеводов анаэробами проводят на предварительно восстановленном пептонно-дрожжевом агаре. Для этого расплавленный и охлажденный до 45°С агар засевают 2-3 каплями культуры. Пробирки закрывают только стерильной фольгой и инкубируют. Положительный результат: образование пузырьков газа в среде.

Предварительно восстановленный агар: восстановленный бульон разливают по 10 мл в пробирки с 0,2 г агара, через который одновременно пропускают азот без кислорода. Затем пробирки закрывают пробками и автоклавируют в зажимном устройстве в течение 15 минут. После автоклавирования среду в пробирке перемешивают путем переворачивания пробирок.

Тест на образование газа при расщеплении углеводов в жидкой среде с углеводами

Данный метод является чувствительным и позволяет выявить газообразование, когда в других тестах его обнаружить не удается. Испытуемую культуру выращивают в среде с тиогликолатом в течение 48-72 часов, затем раскаленную бактериологическую петлю погружают в среду вдоль стенки пробирки. Положительный результат — появление пузырьков газа по линии введения петли.

Приготовление жидкой среды с тиогликолатом. Обработанный панкреатином казеин — 15 г, L-цистеин — 0,5 г, безводная декстроза — 5 г, дрожжевой экстракт — 5 г, хлористый натрий — 2,5 г, тиогликолат натрия — 0,5 г, резазурин — 0,001 г, агар — 0,75 г, дистиллированная вода — 1000 мл, устанавливают рН 7,1, автоклавируют при 121°С в течение 15 минут. Хранят при комнатной температуре в пробирках с плотно закрепленными пробками, если треть среды окислилась (порозовение), то среду не используют.

Определение способа утилизации углевода

Важное значение при идентификации бактерий имеет определение способа утилизации углеводов, т.е. способности к дыхательному метаболизму или брожению (субстратному фосфорилированию), что определяют по расщеплению углевододов в соответствующих условиях (оксидационно-ферментативный тест, тест Хью-Ляйфсона). Эти условия позволяют отнести бактерии к одной из трех групп: 1. Утилизирующие углеводы путем ферментации (брожение); 2. Утилизирующие углеводы путем оксидации (дыхание); 3. Инертные к углеводам.

Установить способность, микроорганизма к сбраживанию углевода можно путем посева на трехсахарный агар с железом (среда ТSI). На поверхность среды и уколом в столбик засевают 18-24-часовую культуру (агаровую, бульонную), посевы инкубируют при 37-38°С в течение 7 суток. К бактериям-бродильщикам относят культуры, дающие кислую реакцию через 24 часа только в столбике или в столбике и скошенной части среды. Очень требовательные к питательным средам бродильщики могут не закислять субстрат. Бактерии с дыхательным типом метаболизма не подкисляют среду или подщелачивают ее, поскольку при окислении количество кислых продуктов меньше, чем при брожении, а также за счет их нейтрализации щелочными продуктами, образующимися при расщеплении пептона. Если изменений в среде нет либо результат сомнительный, то культуру исследуют в тесте окисления-брожения (тест Хью-Ляйфсона, ОФ-тест). Для этого исследуемую культуру засевают в пробирки со средой Хью-Ляйфсона, которая содержит меньше пептона и является полужидкой, что затрудняет диффузию кислых продуктов из зоны роста, что в сумме приводит к изменению цвета индикатора.

Перед посевом, для удаления кислорода, пробирки с полужидкой средой, углеводом и индикатором 15-20 мин кипятят в водяной бане. Затем охлаждают под струей холодной воды и сразу же две пробирки засевают уколом испытуемой культурой. В одну из пробирок после посева наливают стерильное вазелиновое масло слоем в 1 см (анаэробная пробирка). Обязательно наличие контрольной засеянной пробирки без углевода и незасеянной с углеводом. Результаты учитывают после инкубации до 7 суток по следующей схеме:

- кислота не образуется в обеих пробирках, значит, микроорганизм не утилизирует данный углевод либо кислоты очень мало;

- образование кислоты только в аэробной пробирке (без вазелинового масла) указывает на расщепление углевода путем окисления;

- если кислота образовались в обеих пробирках, то микроорганизм способен расщеплять углевод также путем брожения.

Среда Хью-Ляйфсона: пептон (панкреатический гидролизат казеина) — 2 г, натрия хлорид – 5 г, К₂НРО₄ – 0,3 г, бромтимоловый синий – 0,03 г, агар - 3 г, вода дистиллированная – 1000 мл.

Компоненты смешивают, устанавливают рН 7,1-7,2, кипятят до растворения агара, разливают в стерильные пробирки по 5 мл, стерилизуют в автоклаве при 110^оС 30 минут, охлаждают до 45^оС и добавляют 0,5 мл стерилизованного фильтрацией 10%-ного раствора углевода. Среду можно хранить 2-3дня при 4^оС.

Некоторые виды бактерий не могут расти на среде Хью-Ляйфсона. В этом случае ее обогащают добавками дрожжевого экстракта (0,1%), сыворотки крови (2%). У бактерий, не осуществляющих брожение, обычно проверяют способность к кислотообразованию на глюкозе, ксилозе, манните, лактозе, сахарозе и мальтозе.

Если расщепление углевода маскируется за счет защелачивания среды продуктами распада пептона, следует использовать синтетическую среду Борда-Холдинга: NН₄Н₂РO₄ — 0,5 г, К₂НРO₄ — 0,5 г, дрожжевой экстракт (сухой) — 0,5 г, бромтимоловый синий — 0,03 г, раствор минеральных элементов — 20 мл, агар — 5 г, вода дистиллированная — 880 мл.

Раствор минеральных солей: нитрилотриуксусная кислота — 10 г, МgSO₄ 14.45 г, СаC1₂ ·2Н₂О — 3,335 г, (NH₄)₆Mo₇O₄·4 H₂O — 0,00925 г, FеSO₄·7H₂O – 0,099 г, основной солевой раствор — 50 мл (ЭДТА 2,5 г; ZnSO₄·7H₂O – 10,95 г; FеSO₄·7Н₂O — 5 г; МgSO₄·Н₂О — 1,54 г; СuSO₄·5 H₂O – 0,392 г; Co(NО₃)₂·6Н₂О – 0,248 г; Nа₂В₄O₇·10 Н₂О — 0,177 г; вода дистиллированная – 950 мл.

К основному соленому раствору добавляют несколько капель серной кислоты. При изготовлении минерального раствора после добавления нитрилотриуксусной кислоты вода закисляется, ее необходимо нейтрализовать, добавив около 7,3 мл КОН. Нейтрализовав воду, растворяют остальные вещества и устанавливают рН 6,8.

Окисление глюкозы с образованием 2-кетоглюконата

Культуру бактерий выращивают в жидкой питательной среде с глюко-натом калия. В ходе инкубирования посевов из пробирки стерильно периодически берут 1 мл среды и добавляют 1 мл реактива Бенедикта. Полученную смесь помещают на 10 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают под холодной водой. Положительная реакция — появление желто-коричневого осадка.

В состав жидкой питательной среды входят: триптон — 1,5 г, дрожжевой экстракт сухой — 1 г, К₂НРО₄ — 1 г, глюконат калия — 40 г, вода дистиллированная — 1000 мл. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,0, стерилизуют фильтрованием.

Реактив Бенедикта: цитрат натрия — 17,3 г, Na₂CO₃ – 10 г, CuSO₄ · 5 H₂O – 3 г, вода дистиллированная — 100 мл. В 80 мл воды при нагревании растворяют цитрат натрия и Na₂CO₃. Полученный раствор фильтруют через бумагу и доводят объем дистиллированной воды до 85 мл. Далее в 10 мл воды растворяют CuSO₄, оба раствора объединяют и объем смеси доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Метилрот-тест

При расщеплении глюкозы происходит снижение рН среды, что улавливается при помощи метилрота как индикатора в диапазоне рН 4,4-6,0. Испытуемую культуру засевают в жидкую питательную среду Кларка с глюкозой и инкубируют при 37°С 2-5 суток. Затем на 5 мл питательной среды добавляют 5-6 капель раствора метилрота и учитывают результат. Положительная реакция — покраснение среды сразу после внесения индикатора (рН 4,0-5,0), отрицательная — питательная среда желтая (рН 6,0-7,0). Метилрот-тест выполняют в среде Кларка: К₂НРО₄ — 0,5 г, пептон — 0,7 г, глюкоза — 0,5 г, вода дистиллированная — 100 мл. Компоненты растворяют в воде, кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумагу, устанавливают рН 6,9. Стерилизуют 20 минут при 112° С или текучим паром 3 дня по 20 минут. Раствор метилового красного: метилрот — 0,1 г, этанол 95%-ный — 300 мл. После растворения красителя добавляют еще 200 мл дистиллированной воды.

Тест Фогес-Проскауера

Этим тестом выявляют промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкарбинол).

Испытуемую культуру выращивают 4-5 суток на среде Кларка в двух пробирках. Одну пробирку культивируют при 37°С, другую — при 25°С. После окончания культивирования по 1 мл культуры из обеих пробирок переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 мл 6%-ного раствора альфа-нафтола, смесь перемешивают. Затем добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора гидроокиси калия (КОН), тщательно перемешивают и инкубируют в наклонном положении 1 ч. Результаты учитывают через 15 и 60 мин. Положительная реакция — красное окрашивание среды.

Тест на гидролиз крахмала

Оптимальную для изучаемого микроорганизма агаровую питательную среду расплавляют, вносят 0,2% растворимого крахмала, перемешивают, доводят до кипения, стерилизуют при 115°С 10 минут. Испытуемую культуру засевают одним штрихом по диаметру чашки Петри и посевы инкубируют при оптимальной температуре. Затем на поверхность агара наливают раствор йода. Положительная реакция — вдоль штриха образуется бесцветная зона в результате расщепления крахмала. Среда не должна содержать глюкозу, так как бактерии в её присутствии не утилизируют крахмал.

Тест на расщепление крахмала в среде Гиса

Картофельный крахмал (25 г) промывают несколько раз теплой дистиллированной водой, добавляют 500 мл горячей дистиллированной воды, отстаивают. Слой надосадочной жидкости сливают (крахмальная вода). Параллельно готовят пептонно-сывороточную воду: 5 г пептона, 1 г двузамещенного фосфата натрия, 1250 мл дистиллированной воды, 250 мл сыворотки крови лошади, устанавливают рН 7,6. Затем к пептонно-сывороточной среде добавляют 325 мл крахмальной воды, 40 мл 0,02% спиртового раствора фенолового красного, кипятят час в водяной бане, фильтруют через бумагу, разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют текучим паром три дня по 30 минут. Готовая среда имеет розовый цвет. Посевы инкубируют трое суток. Положительный результат — среда желтеет и свертывается.

Тест на гидролиз эскулина

Среду с эскулином засевают одной каплей 24-часовой бульонной культуры и инкубируют при 37°С до 7 суток. Гидролиз эскулина определяют при освещении УФ-лучами. Эскулин после гидролиза флуоресцирует. При отсутствии гидролиза среда становится красновато-черной в результате превращения эскулина в эскулитин, поскольку последний при взаимодействии с солями железа образует комплекс красновато-черного цвета.

Состав среды: эскулин — 1 г, лимоннокислое железо — 0,5 г, агар с экстрактом сердечной мышцы (Дифко) — 40 г, дистиллированная вода — 1000 мл. Среду нагревают до растворения компонентов, охлаждают до 55°С, устанавливают рН 7,0, разливают по пробиркам (5 мл), автоклавируют 15 минут при 121°С, скашивают среду.

Тест на выявление аминосахаразы

Некоторые виды бактерий при помощи фермента аминосахаразы синтезируют из сахарозы полисахарид, взаимодействующий с йодом. Исследуемую культуру засевают на среду в чашке Петри, инкубируют 48 часов. Затем на поверхность культуры наносят 1-2 капли раствора йода и йодида калия. Положительный результат — потемнение колоний с развитием красновато-коричневой или темно-синей окраски. Состав среды: агаровая среда с экстрактом сердечной мышцы (Дифко) — 20 г, сахароза — 25 г, дистиллированная вода — 500 мл, автоклавируют при 121°С в течение 15 минут. Реактив с йодом: раствор, содержащий 1% йода и 2% йодида калия, перед использованием разводят дистиллированной водой 1:5.

Методы обнаружения протеолитических, окислительно-восстановительных, а также других ферментов и продуктов метаболизма

Определение желатиназы

Фермент желатиназа гидролизует аминокислоты белков желатина, в результате чего гель разжижается. Продукцию желатиназы определяют путем засева чистой культуры бактерий уколом в столбик застывшего желатина (обычно используют 12%-ный раствор желатины в жидкой питательной среде). Засеянные пробирки, а также пробирки с незасеянной желатиной инкубируют при температуре 20-22°С или 37-38°С. Опытные и контрольные пробирки охлаждают в холодной воде (12-15°С) или в холодильнике, после чего учитывают результат по «текучести» столбика желатины.

Более чувствительный метод определения желатиназы предложен Фрезиром. В чашки Петри разливают агаровую среду, содержащую 0,4% желатину, засевают исследуемую культуру штрихом и инкубируют при оптимальной температуре 48 ч. Затем на поверхность среды с выросшими колониями наливают реактив (15%-ный раствор НgС1₂ в 20%-ной соляной кислоте). При наличии у микроба желатиназы вокруг колоний наблюдается зона просветления.

Высокочувствительным является ускоренный метод с уголъно-жела-тиновыми дисками. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с жидкой питательной средой. В среду также помещен желатиновый диск с частицами активированного угля на поверхности. При наличии желатиназы желатина на диске разжижается и уголь «сползает» с пластины, распределяясь в питательной среде или формируя черный осадок на дне пробирки.

Ускоренный метод определения желатиназной активности

Скошенную среду засевают большим количеством бактериальной массы бактериологической петлей, посевы инкубируют до 7 суток. Положительный результат — появление розовой или красной окраски среды. Состав среды: фосфорнокислый аммоний двухосновный — 1 г, хлористый калий — 0,2 г, МgSO₄·7Н₂O — 0,2 г, дрожжевой экстракт (Дифко) — 0,5 г, казитон (Дифко) — 0,5 г, желатина (Дифко) — 10 г, агар (Дифко) — 15 г, феноловый красный — 0,02 г.

Компоненты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 6,5, разливают по пробиркам, автоклавируют 10 минут при 121°С.

Тест на плазмокоагулазу и фибринолизин

В пробирку с 0,5 мл стерильной плазмы крови вносят одну бактериологическую петлю агаровой или 0,1 мл бульонной 18-24-часовой культуры испытуемого микроорганизма. Инкубируют при 37^оС и учитывают результат через 30 минут, 2, 4 и 24 ч. Положительный результат — образование плотного или рыхлого сгустка; если использовали разведенную плазму, то сгусток плавает в жидкости.

Одновременно ставят контрольные пробирки с плазмой без бактерии и с культурой микроорганизма, коагулирующего плазму.

При более длительном инкубировании (несколько суток) посевов можно сделать заключение о фибринолитической активности микроорганизма — в присутствии фибринолизина образовавшийся сгусток растворяется.

Приготовление плазмы: используем плазму кролика цельную или разведенную физиологическим раствором 1:2-1:4.

Взятую у кролика пункцией из сердца кровь (10 мл) помещают в пробирку с 1 мл 5%-ного стерильного раствора лимоннокислого натрия, тщательно перемешивают, центрифугируют. Плазму переносят в стерильные пробирки и хранят в холодильнике 4-5 суток.

Фибринолитическую активность определяют высевом испытуемой культуры в виде бляшек на питательный агар с 12% цитрированной плазмы. Предварительно расплавленный агар с плазмой прогревают при 56°С 10 минут. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С. Положительный результат — появление зоны просветления вокруг макроколоний.

Гидролиз казеина

Некоторые микроорганизмы продуцируют фермент казеиназу, гидролизующий казеин. Классическим тестом на гидролиз казеина является посев в молоко. Под воздействием протеолитических ферментов казеин (сгусток казеина) растворяется (пептонизация), и среда приобретает желтоватую окраску. Учет результатов необходимо проводить с небольшими интервалами.

Гидролиз казеина можно определить и на плотных питательных средах без углеводов. Используемое обезжиренное молоко диализуют для удаления лактозы (ингибирует процесс гидролиза казеина). Основой служит питательная среда с двойной концентрацией агар-агара, к которой добавляют равный объем стерилизованного автоклавированием диализованного молока. Используемую культуру бактерий засевают штрихом в чашки Петри с питательной средой. Срок инкубации — 14 дней. Перед учетом результатов поверхность среды заливают 10%-ным раствором соляной кислоты. Положительный результат — просветление среды вокруг колоний.

Характер действия бактерий на лакмусовое молоко

В результате выращивания бактерий на лакмусовом молоке выявляют следующие признаки: образование кислоты при сбраживании лактозы, расщепление казеина, коагуляцию казеина, восстановление лакмусового индикатора.

Испытуемую культуру засевают в пробирку с лакмусовым молоком инкубируют при 37°С до 7 суток с ежедневным учетом результатов, при этом возможны следующие изменения: подщелачивание — среда синеет, закисление – среда розовеет, обесцвечивание — восстановление индикатора (лакмуса), что обычно происходит в нижней части пробирки, образование кислого творожистого осадка — плотный розовый сгусток, который не сжимается и растворяется в щелочи, формирование творожистого осадка сычужного типа — мягкий, нерастворимый в щелочи сгусток, пептонизация (протеолиз казеина) – молоко, начиная с верхней части среды, становится полупрозрачным, обычно пептонизация сопровождается защелочением среды.

Приготовление лакмусового молока. В 150 мл 40%-ного этанола измельчают 50 г лакмуса, кипятят в водяной бане 1 минуту, жидкость сливают (сохраняют), к осадку добавляют 150 мл этанола и процедуру повторяют. Первый и второй раствор объединяют и через 18-20 часов добавляют этанол до 300 мл, устанавливают при помощи 1N NаОН рН 7,0. Затем в снятое молоко добавляют лакмус до сине-фиолетового окрашивания (цвет среды), устанавливают при помощи 1N NаОН рН 7,0, стерилизуют при 115°С и течение 10 минут (не перегревать!).

При изучении анаэробных бактерий используют специальную восстановленную молочную среду следующего состава: снятое молоко — 100 мл, раствор резазурина, 0,025%-ный — 0,4 мл, раствор гемина — 1,0 мл, раствор витамина К₁ — 0,02 мл. После кипячения молока добавляют гемин и витамин К₁. Затем через среду пропускают СО₂. Конечный рН среды должен быть 7,1. Сразу разливают в пробирки предварительно заполненные газообразным азотом, закрывают пробирки и автоклавируют при 121° С в течение 12 минут.

Приготовление раствора гемина: 0,05 г гемина растворяют в 1 мл 1N NаОН, добавляют дистиллированную воду до 100 мл, автоклавируют при 121° С в течение 15 минут.

Приготовление раствора витамина К₁: 0,15 мл витамина К₁ вносят в 30 мл 96%-ного этанола.

Разложение мяса анаэробами

Испытуемую культуру засевают в предварительно восстановленный бульон, содержащий рубленное мясо и одновременно через пробирку продувают свободную от кислорода СО₂. Инкубируют посевы три недели. Положительный результат — мясо переварено, на дне пробирки образовалась рыхлая порошкообразная масса.

Состав восстановленного бульона: пептон — 50 г, триптиказа — 5,0 г, дрожжевой экстракт — 10,0 г, резазурин 0,25%-ный — 4,0 мл, солевой раствор — 40,0 мл, раствор гемина — 10,0 мл, раствор витамина К₁ — 2 мл, цистеин НС1 — 0,5 г, дистиллированная вода — 1000 мл. Солевой раствор: СаС1₂ (безводный) — 0,2 г, МgSO₄ ·7Н₂0 — 0,48 г, К₂НРO₄ — 1,0 г, КН₂РО₄ — 1,0 г, NaНСО₃ – 10,0, NaCl – 2,0 г, СaCl₂ и MgSO₄ растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Вливают 500 мл дистиллированной воды и, помешивая, добавляют остальные соли. После растворения солей добавляют 200 мл дистиллированной воды.

Раствор гемина: гемин – 0,05 г, NaОН 1N – 1,0 мл, раствор гемина доливают дистиллированной водой до 100 мл. Автоклавируют при 121^о С в течение 15 минут.

Раствор витамина К₁: витамин К₁ (0,15 мл) растворяют в 30 мл 96%-ного этанола.

Сухие компоненты при изготовлении среды помещают в колбу с вертикальным отводом для предотвращения перекипания. Затем добавляют воду, солевой раствор и резазурин, кипятят, пока резазурин не обесцветится. Затем в колбу вместо отвода вставляют форштосс с двумя отводами, в один из которых вставлена газоотводная трубка, помещают колбу в ледяную баню. Пока среда охлаждается до комнатной температуры, через нее пропускают обескислороженный СО₂.

После охлаждения вносят гемин, витамин К₁ и цистеин, устанавливают рН 7,1, используя 8N NаОН. Продолжают пропускание через среду СО₂ пока рН не достигнет 6,9. Далее через среду пропускают обескислороженный азот, одновременно разливают ее по пробиркам, через которые уже был пропущен азот. Удаляют из пробирок газоотводные трубки и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки автоклавируют в зажимном устройстве в течение 15 минут. После охлаждения пробирки, в которых среда окрашена в бело-розовый цвет, что говорит об окислении, выбраковывают.

Определение каталазы

Метод 1. 16-18-часовую культуру смывают с поверхности агаровой среды в чашке Петри 10 мл изотонического раствора хлорида натрия, помещают в бактериологическую пробирку и добавляют 5 мл 1%-ного раствора перекиси водорода (1 часть пергидроля + 29 частей воды). Содержимое пробирки перемешивают и выдерживают при 20-25°С. Результат учитывают сразу и в течение 30-60 мин. При наличии каталазы видны выделяемые пузырьки газа.

Метод 2. Бактериальную массу снимают с поверхности агаровой среды бактериологической петлей или тонким стеклянным шпателем и суспензируют в капле 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. Результат учитывают невооруженным глазом или под малым увеличением микроскопа сразу и через 5 мин. Оценивают по наличию пузырьков газа.

Метод 3. Каталазную активность тестируют непосредственно у выросших культур на средах. Для этого на поверхность культуры на скошенном агаре, или на колонии в чашке Петри, или на поверхность полужидкого агара наносят несколько капель 3%-ной перекиси водорода. В бульонную культуру добавляют 0,5 мл 3%-ной перекиси водорода. При наличии каталазы появляются пузырьки газа (атомарный кислород, отщепленный каталазой от перекиси водорода).

Культуры, выращенные на кровяных средах, испытывать на наличие каталазы этим способом нельзя из-за каталазной активности питательной среды. При испытании культуры анаэробов необходимо выдержать их при доступе воздуха 30 минут.

Определение оксидазы

Метод 1. Испытуемую культуру выращивают 18-20 ч на агаровой среде в чашке Петри. Поверхность среды заливают приготовленным перед употреблением 1%-ным водным раствором тетраметил-парафенилендиамина дигидрохлорида (или диметил-парафенилендиамина). Чашку наклоняют, чтобы раствор стек, и через 20-30 сек учитывают результат. Колонии бактерий, образующих оксидазу, приобретают пурпурный цвет.

Метод 2. Полоску фильтровальной бумаги пропитывают 1%-ным раствором тетраметил-парафенилендиамина дигидрохлорида. Платиновой бактериологической петлей или запаянной пастеровской пипеткой бактериальную массу из интересующей колонии наносят на смоченную реактивом бумагу. Через 10-60 секунд учитывают результат. В положительном случае появляется фиолетовое или пурпурное окрашивание. Нельзя использовать бактериологические петли из других видов металлов, т.к. появляются ложные положительные реакции.

Метод 3. Испытуемую культуру бактерий выращивают на агаровой среде в чашках Петри или пробирках с питательным бульоном. Затем на колонии наносят несколько капель реактива следующего состава: 1%-ный раствор α-нафтола в 96%-ном этаноле смешивают 1:1 с приготовленным ех tempore 1%-ным водным раствором оксалата диметилпарафенилендиамина. В бульонную культуру добавляют 0,2 мл раствора α-нафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина, содержимое пробирки перемешивают. Результаты учитывают в течение 30 сек. При наличии оксидазы происходит окрашивание бульона или колоний в фиолетово-синий цвет.

Определение редуцирующей способности бактерий

При окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода могут быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются. Такими свойствами обладают красители: индигокармин, лакмусовая настойка, малахитовый зеленый, метиленовый синий и др. Их добавляют в МПБ, молоко, МПА.

Молоко с метиленовым синим. Обезжиренное молоко подщелачивают 10%-ным раствором Nа₂СО₃ до рН 7,2. Добавляют 20 мл 1%-ного водного раствора метиленового синего на 1000 мл молока, разливают по 5 мл в бактериологические пробирки и стерилизуют трехкратно текучим паром. Готовая среда имеет голубой цвет. Среду засевают путем внесения одной бактериологической петли культуры, снятой с плотной питательной среды, или 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры. Результаты учитывают через 24 ч инкубирования. Если микроорганизм редуцирует метиленовую синь, то среда окрашивается в кремовый цвет. При слабой редукции происходит окрашивание в зеленый цвет.

Редукция других красителей. В МПА и МПБ красители добавляют непосредственно перед посевом исследуемой культуры бактерий из расчета: нейтральрот – 1-2 мл 2%-ного водного раствора на 100 мл среды, индигокармин – 1 мл 5%-ного водного раствора на 100 мл среды, метиловый синий – 1 мл 1%-ного водного раствора на 100 мл среды, лакмусовую настойку – 1 мл на 100 мл среды. Среды с красителями стерилизуют текучим паром дробно, хранению они не подлежат. Плотные среды в пробирки разливают столбиком.

На плотные среды посев культуры бактерий производят уколом в столбик. При замедленной редукции, для предотвращения окисления за счет кислорода воздуха, поверхность жидкой питательной среды покрывают стерильным вазелиновым маслом. Необходимо иметь контрольные пробирки с незасеянной средой. Исходный цвет среды с нейтральротом — красный, при редукции — желтый; метиленовый синий при полной редукции обесцвечивается, при слабой — цвет среды зеленоватый; среда с индиго-кармином в итоге редукции обесцвечивается.

Определение липазы

Метод 1. Культуру бактерий засевают штрихом на агаровую среду в чашках Петри с окрашенным жиром определенного типа. После инкубирования учитывают результат. Положительная реакция — синий ореол вокруг колоний.

Для приготовления среды с окрашенным жиром в насыщенный водный раствор нильского голубого сернокислого по каплям добавляют 1N NаОН до прекращения образования осадка. Раствор фильтруют, осадок собирают, отмывают центрифугированием дистиллированной водой с рН 7,5, высушивают и используют по мере необходимости (порошок).

Приготовление окрашенного жира. Из порошка красителя готовят насыщенный раствор и смешивают 1 мл красителя с 10 мл жира. Если жир плотный, всю процедуру проводят в водяной бане. Можно использовать любой жир (свиной, молочный, говяжий, а также льняное, хлопковое, кукурузное масло).

При использовании твердых жиров смесь жира с красителем несколько раз промывают горячей водой. Затем к 90 мл 0,5%-ного питательного агара (рН 7,0) добавляют 10 мл жира. Смесь стерилизуют автоклавированием.

В случае жидких жиров к смеси жира и красителя в делительной воронке добавляют в соотношении 1:2 диэтиловый эфир. Эфирный окрашенный слой отделяют от воды и несколько раз промывают водой (работа проводится в вытяжном шкафу). Отделяют эфирный слой, содержащий жир, и выпаривают эфир. Удалив из жира остатки воды, стерилизуют его автоклавированием и хранят в холодильнике.

Приготовление сред. К основной расплавленной стерильной агаровой питательной среде добавляют 1 мл окрашенного жидкого жира на 10 мл среды или 1 мл эмульсии твердых жиров на 20 мл среды. Смесь тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Метод 2. О наличии липазы судят по способности расщеплять твин-40 (эфирпальмитиновая кислота), твин-60 (эфирстеариновая кислота), твин-80 (эфиролеиновая кислота).

Испытуемую культуру бактерий засевают штрихом на агаровую среду с твином в чашках Петри. После инкубирования учитывают результат. Положительная реакция — помутнение среды вокруг колонии.

Для приготовления питательной среды твин-40, 60 или 80 стерилизуют автоклавированием при 121°С 20 минут. Расплавленный питательный агар остужают до 45-50°С, добавляют 1% (по объему) твина. Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Метод 3. Испытуемую культуру бактерий засевают штрихом на желточный агар в чашках Петри. После инкубирования учитывают результат. Положительная реакция — маслянистый, блестящий или перламутровый налет на колонии и около нее на поверхности агара.

Выявление лецитиназы

Лецитиназа относится к группе ферментов фосфолипаз. Она способна расщеплять гидролизом лецитин.

Культуру бактерий засевают штрихом на желточный агар с целью получения изолированных колоний. После инкубирования учитывают результат. Положительная реакция — зона помутнения вокруг колоний.

Желточный агар: пептон — 20 г, Nа₂НРO₄ — 2,5 г, NаС1 — 1 г, 0,5%-ный раствор МgSO₄ — 0,1 мл, глюкоза — 1 г, агар — 12,5 г, вода дистиллированная — 500 мл. Растворяют в воде компоненты, устанавливают рН 7,3-7,4, расплавляют агар, стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут, охлаждают до 55-60°С в водяной бане. Куриные яйца помещают на 1ч в 96%-ный этанол, асептически извлекают желток и помещают его в среду из расчета 1 желток на 500 мл. Тщательно перемешивают среду и разливают по чашкам Петри. Для изучения анаэробов среду используют в течение 4 ч после изготовления или хранят в анаэростате.

Редукция нитратов

Микроорганизмы могут восстанавливать нитраты до нитритов, аммиака или элементарного азота (денитрификация).

Метод 1. Является количественным методом определения нитритов. Испольчуют жидкую питательную среду с добавлением 0,1% КNО₃ и 0,17% агара. Испытуемую культуру осторожно засевают с таким расчетом, чтобы посевной материал равномерно распределился в питательной среде и в ней отсутствовали пузырьки воздуха. Посевы инкубируют при оптимальной температуре, результаты учитывают через 1, 2, 4 и 7 дней. В указанные сроки в пробирку отирают 0,1 мл культуры, добавляют 2 мл реактива, затем дистиллированную воду до 4 мл. Через 15 минут учитывают окрашивание среды. Положительный результат — красный цвет.

Если в культуре не выявляется нитрит, проверяют наличие нитрата добавлением цинковой пыли из расчета 5 мг на 1 мл смеси. Красное окрашивание свидетельствует о наличии нитрата и, следовательно, отсутствии у микроорганизма способности к его редукции. Если после добавления цинка цвет среды не изменился, значит, наступила полная денитрификация (полное восстановление нитрита в азот). Обнаружение пузырьков газа в толще среды в процессе культивирования также подтверждает процесс денитрификации.

Для выявления нитритов готовят два раствора. Раствор А: N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорид — 0,02 г, 1,5N раствор НС1 — 100 мл. Растворяют при подогревании в вытяжном шкафу.

Раствор Б: сульфаниловая кислота — 1,0 г, 1,5N раствора НС1 — 100 мл. Растворяют при осторожном подогревании.

Растворы А и Б хранят отдельно и смешивают в равной пропорции непосредственно перед употреблением. Реактив Грисса с применением альфа-нафтиламина желательно не использовать, т.к. у препарата обнаружены канцерогенные свойства.

Метод 2. В МПБ добавляют 0,2% КNO₃, среду стерилизуют при 120°С 15 минут, засевают испытуемой культурой и инкубируют 48-72 ч. Обязательно наличие контрольной незасеянной пробирки. В опытную и контрольную пробирку после срока инкубации добавляют 1 мл реактива с крахмалом. Темно-синее окрашивание питательной среды свидетельствует о восстановлении натрата в нитриты.

Для реактива вначале готовят крахмал. 250 г картофельного крахмала промывают в 1 л дистиллированной воды, отстаивают, воду сливают; осадок заливают на 1-2 ч 4%-ным раствором НС1 в дистиллированной воде, фильтруют. Собранный с фильтра крахмал промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивают при 90°С. Навеску растворимого крахмала в количестве 1 г помещают в 100 мл кипящей дистиллированной воды и после охлаждения раствора добавляют 0,5 г йодистого калия (раствор А). Готовят 10%-ный водный раствор хлористоводородной кислоты (раствор Б). Перед применением растворы А и Б смешивают (1:1). Срок годности реактива 15 минут.

Определение редукции нитратов в полуаэробной жидкой среде. Данный способ используют при проверке некоторых псевдомонад, не редуцирующих нитрат на обычных средах.

Испытуемую культуру засевают в количестве 5-7 капель в пробирку со специальной средой при помощи пастеровской пипетки. Культуру вначале вносят на дно пробирки, постепенно поднимая пипетку к поверхности среды, стараясь не образовывать пузырьков. Посевы инкубируют 24 часа и пересевают на такую же среду, предварительно расплавленную и охлажденную до 40°С. Затем на поверхность среды вносят слой вазелинового масла (1см). Пробирки инкубируют до 7 суток, определяя наличие газа на границе среды и масла и рост в стороне от линии укола.

Состав среды: фосфатный буфер (рН 6,8) — 40 мл, синтетическая среда Хатнера — 20 мл, сернокислый аммоний — 1 г, глицерин —10 г, азотно-кислый калий — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, дистиллированная вода до 800 мл. После растворения среду стерилизуют фильтрованием. Затем в 200 мл дистиллированной воды растворяют 1 г ионагара, автоклавируют при 121°С в течение 15 минут. Среду и агар смешивают, разливают по 5 мл и пробирки (с завинчивающимися пробками).

Синтетическая среда Хатнера: нитрилтриуксусную кислоту (10 г) растворяют и нейтрализуют КОН, добавляют сернокислый магний — 14,45 г, NаС1₂·5Н₂О — 3,335 г, FеSO₄·7Н₂О — 0,099 г, (NН₄)₂МоO₄·Н₂0 — 0,0093 мг и 50 мл концентрированного раствора солей.

Концентрированный раствор солей: ЭДТА — 2,5 г, ZnSO₄·7Н₂0 — 10,95 г, МnSO₄·Н₂0 — 1,54 г, СиSO₄·5Н₂0 — 0,392 г, Со(NO₃)₂·H₂O — 0,248 г, NаВO₃·10Н₂О — 0,177 г, Н₃РO₄ — несколько капель, дистиллированная вода — до 1000 мл.

Определение фосфатазной активности

Общая фосфатаза. Испытуемую культуру засевают штрихом на поверхность питательного агара с натриевой солью дифосфата фенолфталеина. Посевы культивируют 4-5 суток. Затем, перевернув чашки Петри крышкой вниз, на внутреннюю поверхность крышки помещают каплю 28-30%-ного нашатырного спирта (уд. вес 0,88). При наличии фосфатазы колонии приобретают красный цвет.

При изготовлении среды в качестве основы используют МПА, агар Хоттингера и другие агаровые питательные среды. Агар расплавляют, охлаждают до 45°С и добавляют 1%-ный раствор натриевой соли дифосфата фенолфталеина, стерилизованного фильтрацией, до конечного содержания 0,01%. Содержимое перемешивают и разливают в чашки Петри.

Кислая фосфатаза. Испытуемую культуру выращивают на питательном агаре, смывают бактериальную массу небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида с таким расчетом, чтобы бактериальная суспензия по оптической плотности приближалась к молоку. Затем в стерильную пробирку наливают 0,3 мл суспензии бактерий и 0,3 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 4,8), с растворенным 0,01 М динатрий-n-нитрофенилфосфатом. Компоненты перемешивают и выдерживают при 37°С 6 часов. После инкубации к суспензии добавляют 0,3 мл 0,04 М глицеринового буфера (рН 10,5). рН глицинового буфера предварительно доводят до 10,5 гидроокисью натрия. При наличии кислой фосфатазы суспензия окрашивается в желтый цвет. В контрольной пробирке с физиологическим раствором и остальными компонентами, но без бактерий, цвет не изменяется.

Щелочная фосфатаза. Щелочную фосфатазу выявляют аналогично кислой фосфатазе, но раствор динатрий-n-нитрофенилфосфата готовят на глициновом буфере. На последнем этапе глициновый буфер не добавляют.

Обнаружение гидролиза ДНК и РНК

Метод 1. Испытуемую культуру бактерий засевают штрихом на питательный агар с РНК. Посевы культивируют при оптимальной температуре. Затем на поверхность агара наливают 1N раствор НС1. Положительная реакция — вдоль штриха светлая зона (гидролиз ДНК или РНК). Для приготовления среды с нуклеиновыми кислотами берут 10%-ный раствор РНК и ДНК на дистиллированной воде. ДНК растворяется хорошо, для растворения РНК в воду по каплям добавляют 1N раствор NаОН (рН не более 5,0). Питательный агар расплавляют, добавляют растворы нуклеиновых кислот до конечной 0,2%-ной концентрации каждой. Автоклавируют при 121°С 15 минут и разливают и чашки Петри.

Метод 2. Обнаружение ДНК-азы. Испытуемую культуру засевают штрихом на агаровую среду с ДНК и толуидиновым синим или метиловым зеленым с таким расчетом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют в термостате и учитывают результат. Положительная реакция на среде с толуидиновым синим — розовая зона, с метиленовым зеленым — бесцветная зона вокруг колоний. Метод применим только для аэробных бактерий.

Для приготовления среды в агаровую среду с 0,2% ДНК перед авто-клавированием добавляют раствор метилового зеленого до 0,005%-ной концентрации или толуидиновый синий из расчета 100 мг на 1000 мл. Раствор метилового зеленого готовят следующим способом: 0,5 г навеску краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор неоднократно экстрагируют, добавляя равный объем хлороформа, до полного обесцвечивания его последней порции. Приготовленный раствор красителя хранят при 4-6°С, используя по необходимости.

Ускоренный тест на ДНК-азу. Метод менее чувствителен, чем первый. Из 18-24-часовой агаровой культуры готовят концентрированную суспензию в 0,5 мл среды с ДНК, 2 ч инкубируют при 37^оС и добавляют 2 капли раствора метиленового зеленого (1,6 мл обработанного хлороформом красителя в 100 мл дистиллированной воды). Положительная реакция – отсутствие окрашивания, отрицательная – сине-зеленое окрашивание суспензии.

Среда с ДНК: ДНК – 31,5 мг, 0,1 М раствора СаС1₂ — 5 мл, 0,1 М Раствор MgС1₂ в трис-буферере с рН 7,4 – 5 мл.

Утилизация натрия цитрата

В специальной среде натрия цитрат служит единственным источником углерода. И его расщепление одновременно с азотсодержащими соединениями приводит к образованию щелочных продуктов, что регистрируется при помощи индикатора. Для данной цели используют следующие питательные среды.

Цитратный агар Симмонса: NaС1 — 5 г, МgSO₄·7Н₂O — 0,2 г, К₂НРO₄ (или КH₂РO₄) — 1 г, NH₄·Н₂РO₄ — 1 г или (NН₄)₂PO₄ — 1,5 г, С₆Н₅O₇Nа₃·5Н₂O — 3 г, бромтимоловый синий — 0,08 г, агар — 20 г, вода дистиллированная — 1000 мл. В свежей дистиллированной воде растворяют отмытый агар. Соли отдельно растворяют в небольшом количестве воды и затем смешивают с агаром, устанавливают общий объем 1000 мл. Корректируют рН до 7,2, добавляют 40 мл 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду перемешивают, разливают по 5-7 мл в пробирки и стерилизуют 15 мин при 121°С. После автоклавирования агар скашивают, оставляя столбик высотой 2-2,5 см. Положительный результат — среда синеет.

Цитратный агар Кристенсена. Некоторые виды бактерий не растут на среде Симмонса. Поэтому используют среду Кристенсена, содержащую дополнительные источники углерода. Состав среды: натрия цитрат — 3,0 г, глюкоза — 0,2 г, дрожжевой экстракт (сухой) — 0,5 г (или жидкий — 22 мл), гидрохлорид цистеина — 0,1 г, цитрат железа (II) аммония — 0,4 г, КН₂РО₄ — 1 г, NаС1 —5 г, тиосульфат натрия — 0,08 г, феноловый красный— 0,012 г, агар — 15 г, вода дистиллированная — 1000 мл.

Каждый компонент растворяют в небольшом количестве воды, затем смешивают, доводят объем до 1000 мл и растворяют агар. Среду фильтруют, устанавливают рН 6,7, добавив фенолрот, разливают по 5-6 мл в пробирки и стерилизуют 15 мин при 121°С, после автоклавирования скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см. Положительный результат — среда краснеет.

Приготовление дрожжевого экстракта: 500 г прессованных хлебных дрожжей суспензируют в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят 60 минут, перемешивают, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 121°С. Для осаждения клеток суспензию выдерживают неделю в холодильнике, затем отбирают надосадочную жидкость и консервируют 0,5% хлороформом. Экстракт хранят при 4-6^оС, пригоден несколько месяцев.

Утилизация натрия ацетата

Принцип метода аналогичен определению утилизации цитрата натрия. Натрия ацетат служит единственным источником углерода. Испытуемую культуру засевают на ацетатный агар. Положительный результат — при росте культуры среда меняет оливковый цвет на синий.

Ацетатный агар: МgSO₄·7Н₂O — 5 г, NН₄Н₂РO₄ — 1 г, К₂НРO₄ – 1 г, NaC₂H₂O₂ – 2г, NaCl — 5г, агар — 20 г, бромтимоловый синий — 0,08 г, вода дистиллированная — 1000 мл.

В свежей дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно, смешивают с агаром, устанавливают рН 7,2. Среду фильтруют, добавляют 40 мл 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего, разливают в пробирки по 3-4 мл, стерилизуют 15 минут при 112°С, скашивают. Среду под корковыми пробками при 4° С можно хранить 2 месяца.

Утилизация натрия алгината

В среде натрий алгинат является единственным источником углерода. Основном состав среды такой же, как и в агаре Симмонса, вместо натрия цитрата вводится 2,5 г натрия алгината.

Утилизация малоната

Малонат натрия расщепляют некоторые виды бактерий с образованием щелочных продуктов. Испытуемую культуру засевают в бульон с малонатом натрия. Посевы инкубируют 48 ч при 37-38°С и учитывают результат. При утилизации малоната натрия бледно-оливковый цвет среды изменяется до ярко-синего.

Среда с малонатом: дрожжевой экстракт сухой — 1 г (жидкий — 30 мл), (NН₄)₂SO₄ — 2 г, КН₂РO₄ — 0,4 г, NаС1 — 2 г, натрий малонат (СН₂СООНСООNа) — 3 г, глюкоза — 0,25 г, 0,2%-ный раствор бромтимолового синего — 12 мл, вода дистиллированная — 1000 мл.

В кипящей воде растворяют компоненты в указанной последовательности, фильтруют, доводят до исходного объема, охлаждают, устанавливают рН 6,7. Добавив раствор бромтимолового синего, разливают по 2 мл в пробирки и стерилизуют при 112° С 30 минут.

Комбинированный тест на утилизацию малоната и наличие фенила-ланиндезаминазы. Культуру бактерий засевают в специальную жидкую питательную среду с малонатом и фенилаланином. Посевы инкубируют 48 ч при 37-38° С, затем учитывают результат. Первоначально регистрируют утилизацию малоната (положительный результат — посинение среды). Для выявления расщепления фенилаланина в пробирку с культурой добавляют 3-5 капель 0,1N НС1 до пожелтения среды, затем 3-4 капли 10%-ного водного раствора FеС1₃. Положительный результат – зеленый цвет среды через 2-3 мин после добавления реактива.

Состав среды: дрожжевой экстракт сухой — 1 г (жидкий – 30 мл), натрия малонат — 3 г, L-фенилаланин — 1 г (DL— 2 г), (NH₄)₂SO₄ – 2 г, КH₂РO₄ — 0,4 г, К₂HPO₄ — 0,6 г, NаС1 — 2 г, 0,2%-ный водный раствор бромтимолового синего — 12 мл, вода дистиллированная — 1000 мл.

Компоненты поочередно растворяют в кипящей воде, охлаждают, устанавливают рН с расчетом, чтобы после стерилизации он был ранен 6,6, добавляют индикатор, разливают и стерилизуют 10 минут при 115° С.

Тест на утилизацию органических кислот

Ферментативное расщепление D, L-, I-тартрата, муката, цитрата приводит к образованию веществ, наличие которых устанавливается при помощи индикатора бром тимолового синего и насыщенного раствора ацетата свинца. В тесте на утилизацию муката (слизевая кислота), в отличие от остальных соединений, добавления ацетата свинца не требуется.

Испытуемую культуру бактерий засевают в жидкую питательную среду с указанными органическими субстратами и культивируют 7-14 суток. Положительная реакция — постепенное обесцвечивание среды от темно-голубого до белого цвета, отрицательная — среда мутнеет, но сохраняется исходный синий цвет. Эта реакция является четкой для муката, в остальных случаях перед учетом результатов дополнительно добавляют 0,5 мл насыщенного раствора ацетата свинца на 3-4 мл среды. При его добавлении как положительный результат оценивается выпадение в интервале от нескольких до 30 минут небольшого осадка; при отрицательном результате осадок обильный —до 2/3 объема среды в пробирке.

Состав основной питательной среды: пептон— 10 г, 0,1N раствор NaОН — 8,5 мл, 0,2%-ный водный раствор бромтимолового синего — 12 мл, дистиллированная вода — 1000 мл.

Органические кислоты добавляют в данную питательную среду в следующих количествах: D-винная кислота и ее соли (D-тартрат) — 10 г, L-винная кислота или ее соли (L-тартрат) — 5 г, m-винная кислота или ее соли (I-тартрат, оптически инертное соединение) — 5 г, лимонная кислота или ее соли (цитрат) — 10 г, слизевая кислота (мукат) — 10 г.

Основную питательную среду стерилизуют при 120°С 15 минут, добавляют одну из органических кислот (ее солей), устанавливают рН 7,4, асептически разливают по стерильным пробиркам и 20 минут стерилизуют текучим паром. Исходный цвет среды темно-синий с легким зеленоватым оттенком.

Окисление глюконата натрия (калия) в 2-кетоглюконат

Тест используют для дифференциации эшерихий и клебсиелл. В питательную среду засевают бактериологическую петлю изучаемого микроорганизма. Инкубируют 48 ч при 37^оС, добавляют 1 мл реактива Бенедикта, кипятят 10 минут. Положительный результат – коричневый, оранжевые или рыжевато-коричневый осадок.

Среда с глюконатом: пептон – 1,5 г, дрожжевой экстракт — 1 г, калия гидрофосфат (К₂НРО₄) – 1 г, калия глюконат — 40 г (или глюконат натрия — 37,25 г), вода дистиллированная – 1000 мл.

Компоненты растворяю в воде при подогревании, устанавливают рН 7,0, разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 20 минут при 115° С.

Реактив Бенедикта: натрия цитрат — 17,3 г, натрия карбонат безводный (Na₂СО₃) — 10 г, меди сульфат (СuSO₄·5Н₂0) — 1,73 г, вода дистиллированная — 100 мл. Натрия цитрат и Na₂СO₃ растворяют в 60 мл воды, сульфат меди — в 20 мл воды. При постоянном помешивании второй раствор вливают в первый, добавляют воду до полного объема. Хранить в темном месте, иначе наступит кристаллизация.

Образование аммиака из аргинина

Культуру бактерий засевают в аргининовый бульон и контрольную пробирку с питательной средой без аргинина. Посевы культивируют 3 суток. В опытную и контрольную пробирки добавляют реактив Несслера. Положительная реакция – желтое или оранжевое окрашивание среды.

Реактив Несслера: йодид калия (КI) – 5 г, вода дистиллированная, свободная от аммиака 5 мл. Йодид калия растворяют в воде, приливают насыщенный раствор HgС1₂ до образования осадка, добавляют 20 мл 5N раствора NаОН и до 100 мл дистиллированной воды. Смесь отстаивают, прозрачную надосадочную жидкость сливают и используют.

Аргининовый бульон: триптон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, натрия хлорид — 5 г, L-аргинин · НС1 — 3 г, вода дистиллированная — 1000 мл.

Компоненты растворяют в воде при подогревании, устанавливают рН 7,0, кипятят, фильтруют, автоклавируют.

Выявление лизин -, орнитиндекарбоксилаз и аргининдегидролазы

При расщеплении карбоксильных групп лизина и орнитина образуются амин или диамин и диоксид углерода (СО₂). Аргинин утилизируется до пут-ресцина и СО₂, а при наличии уреазы — до NН₃ и СO₂. Во всех указанных случаях происходит защелачивание среды. Существует несколько методов тестирования этих ферментов.

Метод Моеllera, модифицированный. Испытуемую культуру бактерий засевают в бульон Меллера с той или иной аминокислотой. После посева в пробирки наливают стерильное вазелиновое масло до образования слоя толщиной 1 см. Пробирки инкубируют при 37^оС в течении 4 суток.

Исходный цвет среды — розовый, положительная реакция – фиолетовое окрашивание, слабая положительная — голубовато-серое.

Обязательно наличие контрольных пробирок без аминокислот.

Среда с аминокислотами: мясная вода — 400 мл, пептон — 5 г, глюкоза — 1 г, вода дистиллированная — 600 мл, 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного — 5 мл, L-лизин (или орнитин, или аргинин) — 10 г (аминокислоту DL-формы берут в удвоенном количестве).

Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин., корректируют рН (6,0-6,1), добавляют индикатор и разливают в узкие (агглютинационные) пробирки по 3 мл. Стерилизуют при 110°С 30 мин.

Этот метод наиболее широко используют для идентификации энтеро-бактерий.

Для определения аргининдезаминазы у факультативных анаэробов применяют полужидкую среду Торнли. Испытуемую культуру засевают уколом в столбик среды, заливают стерильным вазелиновым маслом и инкубируют в течение семи суток. Положительный результат: покраснение среды.

Состав полужидкой среды Торнли: пептон — 1,0 г, NaС1 — 5,0 г, К₂НРO₄ — 0,3 г, феноловый красный — 0,01 г, L-аргинин — 10,0 г, агар — 0,3 г, дистиллированная вода — 1000 мл, рН 7,2, стерилизуют автоклавированием.

Выявление фенилаланиндезаминазы

Метод основан на выявлении фенилпировиноградной кислоты, образующейся из фенилаланина, при помощи специального реактива, вызывающего образование соединения зеленого цвета.

Испытуемую культуру засевают в пробирки на скошенный агар с фенилаланином, инкубируют при 37-38° С. На поверхность среды наносят 5 капель 10%-ного водного раствора железа (III) хлорида (FеС1₃). В положительном случае наблюдается зеленое окрашивание среды.

Среда с фенилаланином: дрожжевой экстракт (сухой) — 3 г (жидкий — 100 мл), NаС1 — 5 г, Nа₂НРO₄ — 1 г, L-фенилаланин — 1 г (DL-форма — 2 г), агар — 12 г, вода дистиллированная — 1000 мл.

Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, затем поочередно добавляют компоненты и кипятят до расплавления агара, рН среды должен быть 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают по 2-3 мл в пробирки, стерилизуют 30 минут при 112° С и окашивают. Готовая среда бесцветная. Тест-реактив – раствор FeCl₃. Хранят при 4-5 ^оС в темной склянке.

Определение триптофандезаминазы

В 0,2-0,5 мл 0,2%-ного водного раствора DL-триптофана (рН 6,7-6,9) суспензируют бактериальную массу испытуемой культуры (колонии) Через 30 минут инкубации добавляют 1 каплю 10%-ной соляной кислоты и 1 каплю 10%-ного раствора FеCl₃. Результат учитывают через 5 мин. Положительная реакция — красный цвет среды.

Определение арилсульфатазы

В жидкую питательную среду с дисульфатом трикалийфенолфталеина засевают испытуемую культуру бактерий. Посевы инкубируют при оптимальной температуре 7 суток, затем в пробирку с культурой добавляют по каплям 1N раствор NаОН или 1 М раствор Nа₂СО₃. Положительная реакция — окрашивание среды от бледно-розового до светло-красного цвета. Обязательно наличие контрольной незасеянной пробирки со средой.

Раствор дисульфата трикалийфенолфталеина готовят концентрацией 0,08 М, стерилизуют фильтрацией и добавляют в жидкую питательную среду до конечной концентрации 0,001 М. Среда не должна содержать цистеин, сульфат, тиосульфат как факторы, подавляющие синтез арилсульфатазы.

Определение бетта-галактозидазы

Метод 1. Испытуемую культуру засевают в агаровую среду с ОНФГ уколом до дна пробирки. Посевы инкубируют 18-24 ч при 37-38°С. Положительный результат — окрашивание среды в желтый цвет.

Основой среды является питательный агар, который в количестве 1,3 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды, кипятят 2 минуты, стерилизуют 20 минут при 120° С. Затем агар охлаждают до 45-50° С и добавляют 20 мл раствора ОНФГ. Стерильно разливают питательную среду в пробирки. Среда пригодна при хранении в холодильнике 2-3 месяца.

Приготовление ОНФГ (О-нитрофенил-бетта-D-галактопиранозид): 1 г субстрата растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды при слабом подогревании. Раствор хранят в холодильнике.

Метод 2. Культуру бактерий выращивают на скошенном трехсахар-ном агаре с железом 18 ч при 37-38° С. Бактериальную массу снимают петлей и суспензируют в 0,25 мл 0,85%-ного раствора NaС1 в стерильных пробирках до получения густой суспензии. Добавляют каплю толуола, смесь перемешивают и выдерживают 5 минут при 37-38° С. Затем вносят 0,25 мл реактива ОНФГ, инкубируют в водяной бане при 37°С 24 ч, периодически проверяя цвет среды. Обязательно наличие контрольной пробирки суспензий бактерий. Положительный результат – желтое окрашивание суспензии. Реактив ОНФГ готовят по следующей прописи.

Раствор А: NаН₂РO₄·Н₂0 — 6 г, 30%-ный раствор NaОН — 3 мл вода дистиллированная — 45 мл.

В дистиллированной воде растворяют фосфат натрия, добавляя раствор NaОН, доводят рН до 7,0. Разбавляют дистиллированной водой до 50 мл и хранят в холодильнике.

Реактив ОНФГ: О-нитрофенил-бетта-галактопиранозид — 0,08 г, вода дистиллированная — 15 мл, раствор А — 5 мл.

ОНФГ растворяют в воде при 37° С, затем добавляют раствор А.

Хранят при 4° С, перед использованием подогревают до 37° С.

Гидролиз гиппурата натрия

Испытуемую культуру бактерий выращивают 24 ч на агаровой среде. Одну-две полные петли бактериальной массы суспензируют в пробирке с 0,4 мл раствора гиппурата натрия. Затем пробирку инкубируют в водяной бане 2 ч при 37-38°С и добавляют 0,2 мл нингидринового реактива, не встряхивая пробирки и не вынимая ее из водяной бани. Через 10 минут учитывают результат. Положительная реакция — темно-фиолетовая окраска, отрицательная — слабо-фиолетовая или ее отсутствие.

Нингидриновый реактив: 3,5 г нингидрита растворяют в 1000 мл смеси ацетона и бутанола (1:1).

Раствор гиппурата натрия: в дистиллированной воде растворяют гип-пурат натрия с расчетом получения 1%-ного раствора, разливают по 0,4 мл в пробирки, пробирки хранят до использования при минус 20° С.

Тесты на выявление уреазы

Уреазоактивные бактерии гидролизуют мочевину с образованием аммиака и углекислоты. При этом рН среды сдвигается в щелочную сторону, что устанавливается при помощи индикатора. Для этой цели испытуемую культуру засевают на одну из следующих питательных сред.

Среда Кристенсена: пептон — 1 г, натрия хлорид — 5 г, КН₂РО₄ — 2 г, агар — 20 г, глюкоза — 1 г, 0,2%-ный раствор фенолрота — 6 мл, 20%-ный водный раствор мочевины — 100 мл, вода дистиллированная — 1000 мл.

В воде растворяют соли, пептон и агар, устанавливают рН 6,8-6,9, фильтруют, стерилизуют 20 минут при 115°С. Затем вносят глюкозу, фе-нолрот, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и добавляют стерилизованный фильтрацией раствор мочевины. Среду разливают по пробиркам и скашивают.

Испытуемую культуру засевают на скошенный агар Кристенсена и культивируют 1-4 суток. Положительный результат — покраснение среды.

Если приготовленный 50%-ный раствор мочевины выдержать 3-4 суток в герметично закрытой посуде то микроорганизмы, содержащиеся в нем, погибнут и тогда его можно использовать без фильтрации.

Наряду с агаром Кристенсена для выявления уреазы можно использовать жидкую среду с мочевиной.

Жидкая среда с мочевиной: пептон – 1 г, натрия хлорид — 5 г, КН₂РО₄ — 2 г, глюкоза – 1 г, 50%-ный водный раствор мочевины – 40 мл, 0,2%-ный водный раствор фенолрота —6 мл, вода дистиллированная — 1000 мл.

В воде растворяют соли, пептон, кипятят 3 минуты, затем добавляют глюкозу, устанавливают рН 6,8-6,9, вносят фенолрот, фильтруют и разливают по колбам. Стерилизуют при 115^оС 30 минут, добавляют 2%-ный раствор мочевины и разливают готовую среду по пробиркам.

Многие виды бактерий не способны расти на среде Кристенсена. В этом случае для обнаружения продукции уреазы используют тесты с субстратом (мочевиной) и концентрированной бактериальной суспензией, без выращивания микроорганизма на питательной среде с мочевиной.

Среда Заксе. Готовят 2 раствора. Раствор А: вода дистиллированная — 4 мл, этанол 95%-ный — 2 мл, мочевина — 2 г. Компоненты смешивают. Раствор хранят при 4-6° С, не стерилизуя.

Раствор Б: 0,2%-ный водный раствор фенолрота — 1 мл, КН₂РО₄ — 0,1 г, К₂НРО₄ — 0,1 г, NaС1 — 0,5 г, вода дистиллированная — 100 мл. Компоненты смешивают и стерилизуют текучим паром в течение 60 минут.

Перед использованием смешивают 1 часть раствора А и 19 частей раствора Б.

В маленькие, узкие пробирки (преципитационные) наливают 0,1 мл среды Заксе и суспензируют в ней 1-2 бактериологические петли 18-24-часовой агаровой культуры испытуемого микроорганизма. Пробирки помещают на 30 мин в термостат. Положительный результат — покраснение среды. Обязательно наличие контрольной пробирки со средой без бактерий.

Среда Р. Нуleтоп еt аl. 0,1065%-ный БЭС-буфер (N, N-бис-(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота) — 100 мл, мочевина — 2 г, 0,1%-ный раствор фенолрота — 1 мл.

Компоненты смешивают, рН среды должен составлять 7,0. Стерилизуют фильтрацией и стерильно разливают по 2 мл в пробирки. Испытуемую культуру бактерий выращивают на питательном бульоне, центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспензируют в небольшом количестве стерильного физиологического раствора до получения густой взвеси.

В стерильную пробирку с 2 мл среды добавляют 0,5 мл приготовленной суспензии бактерий. Во вторую пробирку вносят эту же среду, но без мочевины и бактериальную суспензию (контроль). Пробирки выдерживают 24 ч при 37° С. Положительный результат — красно-фиолетово окрашивание среды.

Определение сероводорода

Источниками образования сероводорода могут быть различные соединения серы: органические (цистеин, цистин, метионин) и неорганические (сульфат, сульфит, тиосульфат).

Выявление сероводорода при помощи индикаторных бумажек (наиболее чувствительный метод). Фильтровальную бумагу разрезают на полоски (5-6 х 20-40 мм), смачивают в 5%-ном водном растворе уксуснокислого свинца, высушивают и стерилизуют в пробирках, закрытых ватной пробкой (пригодны длительное время). Испытуемую культуру засевают в пробирку с питательной средой. Индикаторную бумагу помещают в пробирку и закрепляют пробкой таким образом, чтобы нижний ее конец находился приблизительно на 1,5-2 см выше уровня среды и не касался ее. Учет результатов проводят от нескольких суток до 2 недель. Сероводород, выделяемый микроорганизмом, реагирует с ацетатом свинца и образующийся сульфид свинца вызывает почернение бумажки. Отмечают сроки и интенсивность почернения бумажки, по которым можно давать ориентировочную количественную оценку образования сероводорода.

Выявление сероводорода в агаровой среде. В бактериологические пробирки наливают агаровую среду высоким столбиком, так как сероводород лучше образуется при пониженном содержании кислорода. Среда должна содержать источники серы: пептон и тиосульфат натрия (0,008-0,03%), а также 0,025% цитрата железа (III), аммония или 0,015% сульфата железа (II). Культуру бактерий засевают уколом вдоль стенки пробирки. Положительный результат — почернение среды по уколу за счет образования сульфида железа.

Обнаружение сероводорода на среде Клиглер. Агаровая среда Клиглер позволяет тестировать одновременно четыре признака: образование сероводорода, расщепление глюкозы и лактозы, а также образование газа.

Готовую среду Клиглер скашивают в пробирках с таким расчетом, чтобы остался столбик 2-2,5 см. Исходный цвет среды — красновато-бурый или оранжево-красный. Испытуемую культуру засевают уколом в столбик и штрихом по скошенной части агара. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С. При положительном результате на сероводород среда в столбике по уколу чернеет. Окраска скошенной части агара в красный цвет, а столбика в желтый указывает на ферментацию глюкозы, а окраска всей среды в желтый цвет — на ферментацию и глюкозы и лактозы (через 48 ч скошенный участок среды краснеет).

При газообразовании происходит отслоение среды от стенки пробирки, появляются разрывы агара со скоплением в нем газа.

Расщепление углеводов регистрирует фенолрот. Если микроорганизм расщепляет только глюкозу, то, учитывая её малое содержание в среде и сильную аэрацию, она разрушается в скошенной части агара в течение нескольких часов и начинается использование пептонов. Поэтому при учете результатов через 24 часа скошенная часть агара, несмотря на расщепление глюкозы, краснеет (защелачивание) за счет образования аммиака при утилизации пептонов.

В столбике среда остается желтой, так как в анаэробных условиях расщепление глюкозы протекает интенсивно и утилизация пептонов еще отсутствует.

При расщеплении микроорганизмом глюкозы и лактозы через 24 ч происходит пожелтение всей среды (содержание лактозы гораздо больше, чем глюкозы), однако через 48 ч в скошенной части агара может наступить защелачивание и покраснение среды.

При наличии у микроорганизма тиосульфатредуктазы тиосульфат восстанавливается в сульфит с выделением сероводорода. Сероводород взаимодействует с сернокислым железом, образуя сульфид железа черного цвета.

Состав среды Клиглер: мясной бульон — 1000 мл, пептон — 20 г, натрия сульфит (Na₂SO₃) — 0,4 г, натрия тиосульфат (Na₂S₂O₃·5Н₂0) — 0,08 г, агар — 20 г, лактоза — 10 г, глюкоза — 1 г, железо сернокислое (FеSO₄·7Н₂0) — 0,5 г, фенолрот (0,2%-ный раствор в 50%-ном этаноле) — 12 мл. В мясной бульон добавляют пептон, NaC1, натрия сульфат, натрия тиосульфит и агар. Смесь кипятят до растворения агара, устанавливают рН 7,8, вновь кипятят, фильтруют через вату и затем добавляют растворенный в небольшом количестве воды железа сульфат, глюкозу и индикатор.

Среду разливают по 6-7 мл в пробирки, автоклавируют 30 минут при 112°С.

Обнаружение сероводорода на среде ТSI (трехсахарный агар с солями железа). Принцип выявления сероводорода тот же, что и на среде Клиглер. Кроме лактозы и глюкозы в состав среды входит еще сахароза.

Состав среды: мясная вода — 1000 мл, жидкий дрожжевой экстракт — 100 мл (или 3 г сухого), пептон — 20 г, натрия хлорид — 3,5 г, агар — 15 г, FеSO₄·7Н₂0 перекристаллизованный — 0,2 г, Na₂S₂O₃·5Н₂0 — 0,3 г, глюкоза — 1 г, лактоза — 10 г, сахароза — 10 г, 0,2%-ный водный раствор фенолрота — 12 мл.

Среду разливают по 5 мл в пробирки, автоклавируют при 121 ° С в течение 15 минут и скашивают таким образом, чтобы высота столбика была 2,5 см. Посев производят на поверхности среды и уколом в столбик.

Определение индола

Индол (орто-бензопирилл) — продукт глубокого расщепления аминокислоты триптофана. Исследуемый микроорганизм необходимо культивировать в жидкой питательной среде, богатой триптофаном (триптический перевар казеина, бульон Хоттингера, бульон с 0,1% L-триптофана). Среда не должна содержать углеводы, которые могут ингибировать действие фермента и индолообразование, а так же нитриты, присутствие которых дает ложный положительный результат. Желательно испытывать культуры различного возраста. Экстракцию образовавшегося индола из культуры проводят эфиром или ксилолом, добавляя их в объеме 1-3 мл. Пробирку тщательно встряхивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфира (ксилола) и затем осторожно и постепенно добавляют 0,5 мл реактива Эрлиха или Ковача.

Реактив Эрлиха: пара-диметиламинобензоальдегид — 1 г, этанол 96%-ный — 95 мл, хлористоводородная концентрированная кислота (НС1) — 20 мл. В этиловом спирте растворяют пара-диметиламинобензоальдегид, затем добавляют кислоту. Реактив хранят в темной склянке, без доступа света.

Реактив Ковача: пара-диметиламинобензоальдегид — 5,0 г, спирт этиловый 96%-ный — 75,0 мл, НС1 — 25 мл. Спирт подогревают на водяной бане (50-55° С) и растворяют пара-диметиламинобензоальдегид. После охлаждения смеси добавляют кислоту. Раствор хранят при 4-5° С.

После добавления указанных реактивов пробирки выдерживают 5 минут и учитывают результат. Если изучаемый организм образует индол, то на границе культуры и слоя эфира (ксилола) появляется красно-фиолетовое окрашивание в виде диска. В параллельном опыте исследуют на наличие индола незасеянную питательную среду (контроль).

Образование микроорганизмами индола чаще определяют при помощи индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу смачивают слегка подогретым насыщенным раствором щавелевой кислоты, высушивают. Нарезают тонкими полосками и помещают их в пробирки с посевами, фиксируя пробками. Бумажки не должны касаться поверхности питательной среды. При положительной реакции на индол полоска индикаторной бумажки приобретает красный цвет.

Использование индикаторных бумажек позволяет определить большое количество индола; если изучаемый микроорганизм образует малые количества индола, то при использовании индикаторных бумажек он не будет обнаружен. Поэтому при отрицательном результате рекомендуется исследовать культуру при помощи реактивов Эрлиха или Ковача.

Определение гемолизинов бактерий

Бактериальные гемолизины — обширная группа веществ — мембрано-токсинов, которые вызывают разрушение мембраны эритроцитов и их лизис. Различают следующие типы гемолиза и изменения кровяного агара при росте бактерий.

Бетта-гемолиз — полный лизис с образованием светлой, прозрачной, четко очерченной зоны вокруг колоний. Некоторые виды бактерий дают слабый гемолиз непосредственно вокруг или под колониями, но посевы уколом в кровяной агар обеспечивают бета-гемолиз.

Неполный бетта-гемолиз – вокруг колоний формируется широкая зона неполного гемолиза (полностью не обесцвечена) с нечеткими границами.

Альфа-гемолиз – позеленение вокруг колоний и под ними без образования зоны лизиса за счет перехода гемоглобина в метгемоглобин.

Образование зон ингибирования лизиса — эритроциты не лизируются непосредственно около колонии, но на большом расстоянии растворяются.

Феномен скучивания эритроцитов — вокруг колонии формируется узкая зона лизиса, а за ней полоска из скученных эритроцитов.

Различное окрашивание кровяного агара — цвет среды меняется на темно-коричневый, вокруг колоний иногда виден альфа-гемолиз. Или среда приобретает под участками роста бактерий бледно-лиловую или зеленую окраску.

Используют следующие методы определения гемолитической активности бактерий.

Метод 1. Испытуемую культуру бактерий засевают дробно на кровяной агар (5% крови барана) в чашках Петри. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24-48 часов, затем учитывают результат, определяя наличие лизиса эритроцитов и его тип. Некоторые стафилококки проявляют бетта-гемолитическую активность при условии, если после 48-часового инкубирования при 37° С чашки с посевами выдерживают час при 4-5° С. Такой вариант гемолиза называется горяче-холодным.

Метод 2. Этот метод используют для выявления гемолизинов, которые инактивируются в присутствии кислорода. Испытуемую культуру засевают штрихом на агаровую среду без крови, а затем на поверхность наливают кровяной агар. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24-48 часов. Колонии бактерий находятся не на поверхности питательной среды, а в ее толще.

Метод 3. Гемолитическую активность можно обнаружить посевом испытуемой культуры в жидкую питательную среду с 1-1,5% дефибриниро-ванной крови. Можно тестировать наличие гемолизина путем выращивания культуры, например стафилококка, в жидкой питательной среде, затем культуру центрифугируют. Прозрачную надосадочную жидкость разводят стерильным физиологическим раствором 1:10—1:1280 и добавляют к каждому разведению равный объем 3%-ной взвеси эритроцитов, выдерживают смесь в термостате. Результат учитывают через 2 часа, окончательно – через сутки. Метод позволяет дать количественную оценку содержания гемолизина.

Использование систем комбинированного тестирования ферментативной активности бактерий

Помимо рутинных методов, широко используют системы комбинированного тестирования ферментативной активности бактерий. Такие тест-системы разработаны для идентификации бактерий определенных групп (энтеробактерий, вибрионов, стрептококков, энтерококков, коринебактерий, листерий, пастерелл, кампилобактерий и др.). Учет результатов может быть визуальный или автоматический. Идентификацию поводят при помощи таблиц биологической активности, профильных индексов, книги кодов или компьютерной программы.

Достаточно известна подобного типа пластина биохимическая для дифференциации энтеробактерий (ПБДЭ). ПБДЭ позволяет определять 20 ферментативных характеристик (таблица 3).

Таблица 3

Цветовой показатель

Ход работы с ПБДЭ заключается в следующем.

Используют культуры бактерий, выращенные в течение 20-24 суток при 37-38°С на МПА или среде Олькеницкого. Готовят взвесь бактерий в стерильном физиологическом растворе (рН 6,0 ± 0,05) концентрацией 10 единиц мутности по оптическому стандарту.

1. Добавляют по 0,15 мл микробной суспензии во все лунки панели, кроме лунки для обнаружения сероводорода, куда вносят только 1 каплю (0,05 мл) суспензии.

2. Заливают в лунку для обнаружения сероводорода 0,1 мл растопленного и охлажденного до температуры 39 ± 1°С мясопептонного бульона, содержащего 0,6% агара. Для получения четких результатов необходимо добиться осуществления более быстрой диффузии субстрата. Поэтому необходимо перемешать концом раскапывающей пипетки субстрат, инокулят и мясо-пептонный бульон, содержащий 0,6% агара.

3. Для создания анаэробных условий в лунки для определения наличия лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы и образования сероводорода добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла.

4. Закрывают крышку планшета.

5. Выдерживают ПБДЭ в течение 20 ± 2 ч при температуре 37 ± 1°С.

6. После окончания инкубации открывают крышки планшетов и в лунки для выявления фенилаланиндезаминазы добавляют 1 каплю 10%-ного раствора хлорного железа (железо треххлористое водное по ГОСТ 4147-74), для определения ацетилметилкарбинола – 1 каплю 6%-ного раствора альфа-нафтола (альфа-нафтол по ГОСТ 5833-70) и затем 1 каплю 40%-ного раствора гидроокиси калия (калия гидроокись по ГОСТ 24363-80), для выявления индола 1 каплю реактива Эрлиха.

7. Учет результатов проводят визуально в соответствии с цветовым указателем через 4 ± 1 и 20 ± 2 ч инкубации при температуре 37 ± 1^оС. Иногда учет на обнаружение бетта-галактозидазы возможен только через (4±1) ч, поэтому учет результатов производят дважды: через (4±1) и через (20±2) ч.

8. Выявление образования ацетилметилкарбинола осуществляется через 15 ± 5 мин. после закапывания реактивов. Для избежания явления высыхания лунок за время инкубации в термостате рекомендуется заливать воду в донышко планшета.

Наряду с ПБДЭ для идентификации энеробактерий можно использовать системы индикаторные бумажные (СИБ); которые представляют диски или полоски хроматографической бумаги, содержащие субстрат и индикатор, стабилизированные полвиниловым спиртом, а также диски из фотопленки с желатином. СИБ выпускают в виде двух наборов: А — для межродовой идентификации (9 тестов), Б — для видовой идентификации (28 тестов).

Набор «А» позволяет определить утилизацию цитрата натрия, мало-ната натрия, утилизацию лактозы, синтез бетта-галактодидазы, фенилаланин-дезаминазы, уреазы, декарбоксилазы лизина, образование индола, сероводорода.

Набор «Б» позволяет определить утилизацию лактозы, глюкозы, сахарозы, ксилозы, рамнозы, мальтозы, арабинозы, адонита, инозита, дульцита, салицина, сорбита, маннита, цитрата натрия, малоната натрия, дезаминирование фенилаланина, наличие уреазы, бетта-галактозидазы, декарбоксилаз орнитина, лизина, дегидролазы аргинина, желатиназы, образование индола, сероводорода, оксидазы, ацетилметилкарбинола (тест Фогес-Проскауера), утилизацию крахмала, глюкозы в аэробных и анаэробных условиях (тест Хью-Ляйфсона).

Способы применения. Основные требования, предъявляемые при работе с СИБ:

- исследования проводят с чистой культурой, а также с отдельными колониями непосредственно с чашек с дифференциально-диагностическими средами Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агаром;

- в опытные пробирки с рекомендуемыми средами вносят целую петлю суточной агаровой исследуемой культуры или 1 каплю густого смыва (3-4 мл 0,85% раствора натрия хлорида на пробирку с косым агаром);

- погружение дисков в пробирки производят обожженным пинцетом;

- учет результатов реакции предварительный и окончательный приведен в таблице 4;

- критерием правильности учета реакции должны быть четкие различия в окраске по сравнению с контролем (за исключением аминокислот, где в опытной пробирке слабое зеленое окрашивание свидетельствует об отрицательном результате, в то время как в контроле диски с аминокислотами окрашены в желтый цвет);

- основные ошибки при применении СИБ возникают от несоблюдения режима рН, рекомендуемых питательных сред, при использовании посуды, обработанной различными моющими порошками и недостаточно отмытой;

- для ускоренного получения четких результатов необходимо соблюдение температурного режима термостата 37^оС.

Таблица 4

Учет результатов исследования (СИБ)

Ход работы с СИБ

1. Определение оксидазной активности. Агаровую суточную культуру растирают петлей на индикаторной бумажке, помещенной в чашку Петри. На одной бумажке можно исследовать 10-15 культур (не более). Использованные бумажки автоклавируют или обезвреживают кипячением или дезинфицирующим раствором.

2. Определение активности по отношению к углеводам и многоатомным спиртам. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ого раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь погружают диск с соответствующим углеводом или многоатомным спиртом. Среда в пробирках в результате диффузии в нее индикатора становится красной. В случае необходимости учета газообразования рекомендуется использовать небольшой комочек стерильной гигроскопической ваты, который помещают в пробирку с диском для определения утилизации глюкозы. В качестве контроля служат диски, погруженные в стерильный 0,85%-ный раствор натрия хлорида. При изучении ферментации углеводов и многоатомных спиртов наряду с 0,85%-ным раствором натрия хлорида для разлива в пробирки может быть использован мясо-пептонный бульон рН 7,3 ± 1. Пробирки помещают в термостат при 37 ± 1° С.

3. Определение активности бетта-галактозидазы. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85% раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь помещают индикаторный диск и инкубируют в термостате при 37 ± 1°С. В качестве контроля используют диск, помещенный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида.

4. Определение индолообразования. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры. Индикаторную бумажку складывают по намеченной на ней линии вдвое и пинцетом опускают на дно пробирки так, чтобы длинный конец погрузился в суспензию, а короткий конец, имеющий желтовато-серую окраску, находился над поверхностью суспензии: инкубируют в термостате при 37°С. В качестве контроля используют полоску, помещенную в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида.

5. Определение уреазной активности. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры. Затем в эту взвесь погружают индикаторный диск с мочевиной и инкубируют в термостате при 37 ± 1°С. В качестве контроля используют диск, помещенный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида.

6. Определение активности декарбоксилаз лизина, орнитина и дегидро-лазы аргинина. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида в фосфатном буфере рН 5,5 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь погружают индикаторный диск с одной из аминокислот: лизином, аргинином или орнитином, заливают стерильным вазелиновым маслом (0, ± 0,05 мл) и инкубируют в термостате при 37± 1 ° С.

В качестве контроля используют диски с соответствующими аминокислотами, погруженные в пробирки со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида в фосфатном буфере, залитые стерильным вазелиновым маслом 0,2 ± 0,05 мл.

7. Определение активности фенилаланиндезаминазы. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь погружают диск с фенилаланином и инкубируют в термостате при 37 ± 1°С. В качестве контроля используют диск, помещенный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида. После инкубации от 1 до 2 ч в пробирки помещают диски с хлорным железом.

8. Определение продукции сероводорода. Индикаторный диск помещают в бактериологическую пробирку на поверхность полужидкого 0,5 ± 0,1% мясо-пептонного агара рН 7,3 ± 0,1 (или среды Пешкова), засеянного уколом суточной агаровой культуры, что позволяет одновременно определять подвижность. Пробирки помещают в термостат при 37°С. В качестве контроля используют пробирку со стерильным 0,5 ± 0,1% полужидким мясо-пептонным агаром рН 7,3 ±0,1 (или средой Пешкова), на поверхность которого помещают индикаторный диск.

9. Определение утилизации цитрата и малоната натрия. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 5,5 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем на эту взвесь помещают индикаторный диск с цитратом или малонатом натрия и инкубируют в термостате при 37 ± 1^оС. В качестве контроля используют диски, помещенные в пробирки со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида в фосфатном буфере рН 5,5.

10. Определение желатиназной (протеолитической) активности. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-иого раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь помещают диск фотопленки с желатином и инкубируют в термостате при 37 ± 1°С. В качестве контроля используют диск фотопленки с желатином, помещенный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида.

11. Определение ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра). В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь помещают субстратный диск, погруженный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида. Через 20 ± 2 ч инкубации в термостате при 37±1°С в пробирки закапывают по 1-2 капле 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола и 40%-ного едкого калия и инкубируют 15-20 минут в термостате при 37±1°С. 6%-ный спиртовой раствор альфа-нафтола готовят на одну неделю работы, хранят в посуде из темного стекла.

12. Определение амилазной активности. В пробирке с 0,3 мл стерильного 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 суспензируют полную петлю суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь погружают субстратный диск с крахмалом. В качестве контроля используют субстратный диск с крахмалом, погруженный в пробирку со стерильным 0,85%-ным раствором натрия хлорида.

После 20 ± 2 ч инкубации в термостате при 37± 1°С в пробирки помещают индикаторные диски с йодом.

13. Определение утилизации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях (тест Хью-Ляйфсона). В две пробирки разливают по 0,3 мл 1%-ной пептонной воды рН 7,7 ± 0,1 и суспензируют по полной петле суточной агаровой культуры, затем в эту взвесь погружают индикаторные диски. В контрольные пробирки с 0,3 мл 1 %-ной пептонной воды культуру не вносят. В одну опытную и контрольную пробирку вносят стерильное вазелиновое масло 0,2 ± 0,05 мл; инкубируют в термостате при 37 ± 1°С. Окисление глюкозы определяют в пробирке, не залитой маслом. В анаэробных условиях (под слоем вазелинового масла) исследуют ферментацию.

Метод идентификации единичных колоний

При необходимости ускорения хода анализа и исключения этапа выделения чистой культуры может быть проведена идентификация единичных колоний по 9 тестам с помощью СИБ (набора «А») непосредственно с чашек с дифференциально-диагностическими средами Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агаром.

Подлежащую изучению колонию (для исследования может быть использована также петля культуры с дифференциально-диагностических сред Олькеницкого или Ресселя) подращивают в 1,4 ± 0,1 мл подогретой до 37 ± 0,1°С 1%-ной пептонной воды рН 7,3 ±0,1 в течение трех часов при температуре 37 ± 1°С. После подращивания микробную взвесь по одной капле 0,06 ± 0,01 мл вносят в пробирки с 0,3 мл заранее разлитого 0,85%-ного раствора натрия хлорида рН 7,3 ± 0,1 или 0,85%-ного раствора натрия хлорида в фосфатном буфере рН 5,5 ± 0,1 (в зависимости от изучаемого теста) и внесенными туда индикаторными дисками. Наличие бетта-галактозидазы при работе с одной колонией следует определять в 0,85%-ном растворе натрия хлорида в фосфатном буфере рН 5,5 ± 0,1.

Одновременно культуру засевают на скошенный агар для определения оксидазной активности, сероидентификации, фагочувствительности и постановки дополнительных биохимических реакций.

Из зарубежных систем комбинированного тестирования для идентификации энтеробактерий, несбраживающих бактерий часто используют систему АРI 20 Е (Аnа1уtab Ргоducts, Р1аinview, N-Y. 11803).

При помощи данной тест-системы определяют наличие бетта-галактозидазы, аргинин дегидролазы, лизин декарбоксилазы, орнитин декарбоксилазы, способности к утилизации цитратов, продукцию сероводорода, уреазы, индола, ацетоина, желатиназы, каталазы, триптофан деаминазы, цитохром оксидазы, NО₂, редукции NО₃ до газообразного N, ферментацию, оксидацию глюкозы, маннита, инозита, сорбита, рамнозы, сахарозы, мелибиозы, амигдалина и арабинозы. Кроме того, у изучаемых бактерий определяют подвижность и способность к росту на агаре Мак-Конки.

Для изучения отбирают изолированные колонии, бактериальную массу которых суспензируют в 5 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию вносят в микропробирки с субстратами. Пробирки с аргинином, лизином, орнитином, мочевиной и выявления Н₂S заливают стерильным минеральным маслом. Пробирки тест-системы инкубируют во влажной камере при 35-37°С в течение 18-24 часов.

Наличие оксидазы тестируют обычным способом

Для выявления триптофан деаминазы перед учетом результатов в пробирку добавляют одну каплю готового реактива ТДА; для обнаружения индола вносят одну каплю соответствующего реагента и результат учитывают через 10 минут. Наличие того или иного фермента устанавливают на основании критериев, представленных в таблице 5.

Таблица 5

Цветовой показатель API 20E

(1) – бледно-желтый рассматривается как положительный;

(2) – оранжевый цвет после 24 часов инкубации рассматривается как негативный результат;

(3) – проводится в открытом виде (аэробно);

(4) – ферментация начинается в нижней части пробирки, оксидация – в верхней.

Помимо АРI 20 Е за рубежом выпускают систему АРI 20 А для анаэробов (Аnalytab Products), инкубирование микропробирок проводят в течение 24-48 часов в анаэробных условиях. Система Мinitek предназначена для энтеробактерий, нейссерий и анаэробов (ВНL Microbiology Systems, Cockeyswille, MD 21030), состоит из дисков с субстратами в лунках пластмассовой пластины, в случае изучения анаэробов инкубирование проводят в анаэробных условиях.

Разработана система Охi/Ferm для несбраживающих грамотрицательных бактерий, система Согning N/F для окисляющих грамотрицательных бактерий и ряд других систем. К каждой тестовой системе фирма-производитель прилагает перечни признаков и идентификационные таблицы.

Следует помнить, что объективные результаты определения ферментативных признаков могут быть получены только при работе с чистыми культурами, с обязательным контролем дифференциально-диагностических сред, используемых реактивов, тестов, при помощи известных штаммов бактерий, заведомо обладающих определенными ферментами или не имеющих их.

Необходимо принимать во внимание, что при использовании разных сред, реактивов, температуры, времени инкубирования, посевной дозы результаты теста могут варьировать в широком диапазоне.