Определение активности супероксиддисмутазы в модификации

Г.Ю. Мальцева, А.В. Васильева (1994)

Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах крови смешивали раствор 1:50 см3 реагента 1 (2 мМ NaPO x 10 HO, pH 8,3), с 7,5 см3 реагента 2 (0,05 мМ нитросиний тетразолий) и 2 см3 реагента 3 (2,5 мкМ НАДН) непосредственно перед измерением.

Реакционная смесь: 0,32 см3 раствора 1 смешивали с 20 мм3 гомогената отмытых эритроцитов. Старт реакции осуществлялся добавкой 50 мм3 реагента 4 (25 мкМ феназинметосульфат), разведенного в 10 раз.

Режим измерения: время задержки – 10 с., время измерения – 180 с., кинетический режим, температура – 250 C, длина волны на спектрофотометре СФ-46 540 нм, параллельный режим для измерения опытной и контрольной проб. Расчет проводился по формуле:

Активность СОД (усл. ед./мин.) = (1 – A/A )·оп. фон. k·p,

где A – оптическая плотность соответственно в опытной пробе и контроле;

p – разведение пробы;

k – коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.

С целью диагностики супероксиддисмутазы в плазме крови использовался метод, основанный на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН и феназинметасульфата (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается.

В пробирки вносят следующие реагенты: плазму крови – 0,05 мл, реагент 1 (62 мг ЭДТА, 500 мг НСТ, 92 мг феназинметасульфата растворяют в 1000 мл фосфатного буфера, рН 7,8) – 2 мл, реагент 2 (76,3 мг НАДН растворяют в 100 мл ТРИС-ЭДТА буфера, рН 8,0) – 0,1 мл.

Реакцию проводят при температуре 250 С. Измерение ведут в кювете с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. После перемешивания компонентов пробы в кювете устанавливают начальную экстинкцию. Через 10 мин. измеряют нарастание оптической плотности раствора.

Расчет ведут по формуле:

блокирования, где

Ео – экстинкция реакционной смеси в отсутствии СОД (нулевой пробы) в состоянии равновесия;

Епр – экстинкция исследуемой пробы в состоянии равновесия.

За единицу активности принимают 50% торможения реакции восстановления НСТ, активность фермента выражают в усл.ед. на 1 мг белка.