Динамика автолиза дрожжей

Определив преимущества СНЖК как индуктора автолиза микроорганизмов, вызывающих нарушения структурной организации и функциональной активности клеточных мембран, остано­вимся на выяснении условий оптимизации саморазрушения клеток, что является вторым этапом в разработке технологии.

показателям накопления в инкубационной среде продуктов гидролиза клеточных био­полимеров.

На рис. 6 приведены данные о влиянии температуры и pH инкубационной среды на протеолитическую активность автолитиче­ского комплекса дрожжей. Об активности протеаз можно судить по образованию в ре­зультате гидролиза белков полипептидов с числом аминокислотных остатков не менее 4 (биуретовая реакция), а так же по накопле­нию в среде свободных аминокислот, опреде­ляемых формольным титрованием.

Первая отмеченная закономерность — несовпадение зависимости ингибирования дыхания и разрушения клеток от pH среды.

Если ингибирование дыхания и падение числа КОЕ максимальны при pH 3-4 (рис. 3), то преимущественное высвобожде­ние из клеток продуктов гидролиза белка наблюдается при pH 6-8 (рис. 6). Не менее важно, что максимальное ингибирование

Рис. 6. Зависимость глубины автолиза клеток Ft. aurantiaca от условий ведения процесса Индуктор препарат СНЖК, 80 мкг мл; время ведения процесса - 4 ч; глубина автолиза количество растворимого белка в инкубационной сребе, от общего содержания белка в нативных клетках

дыхания (рис.

Приведенные результаты еще раз акцентируют внимание на том факте, что процесс индукци автолиза и собственно автолитическое разрушение структур различаются принципиально как п цели, так и по условиям достижения этой цели. При разработке технологических режимов автг лиза микроорганизмов (дрожжей) процесс следует индуцировать внесением СНЖК при подкиг лении среды до значений pH < 4,5, а саму деструкцию клеток вести в близкой к нейтральной ил слабощелочной областях pH (до 6,5-7,8), оптимальных для клеточных протеиназ. Зависимост гидролиза биополимеров от температуры стандартна для кинетики ферментативных реакци (рис. 6), и скорость гидролиза возрастает с увеличением температуры. Следует отметить, что ш вышение температуры выше 60 "С всегда приводит к снижению скорости автолиза дрожже вплоть до его прекращения, что объясняется инактивацией дрожжевых протеаз, вследствие на рушения интактности лизосом и образования неактивных комплексов лизосомальных протеаз ингибиторами, находящимися в цитозоле.

Проанализируем вышеизложенные данные. Еще раз напомним, что автолитические процес сы — это постоянно присутствующая активность биохимических гидролитических процессов определяющих физиологию роста и развития любой клетки: от оборота клеточного материал и субклеточных структур до роста клетки и ее разделения (септации, почкования, перетяжки дробления, апикального роста и т.д.).

Дисбаланс синтетических и автолитических процессов, естественно возникающий в клетка стареющей культуры или являющийся следствием внешних воздействий (индукции), в польз; автолитических, является причиной необратимого разрушения клеточных структур и, в перву? очередь, клеточной оболочки, что приводит к гибели клеток.

Поэтому для разработки технологий автолиза существенное значение имеют, с одной сторс ны, знания об ультраструктурной организации эукариотной клетки, ее органеллах, локализь. ции ферментов и их ингибиторов; с другой — информация о природе гидролаз, включающих ка: истинные автолизины, разрушающие материал клеточной стенки, и липазы, гидролизующи мембранные липиды, так и ферменты протеолитического комплекса, являющиеся ключевым, и для осуществления физиологических автолитических процессов, и для автолиза как процесс гибели клетки.

Табл. 3. Влияние подкисления среды при индукции автолиза на интенсивность саморастворения клеток дрожжей R.aurantiaca (12% МСК)

Табл. 4.

Из протеиназ дрожжевых клеток особое внимание привлекает Ysc А, локализованная в ак­тивной форме в лизосомах, по выходе из которых она связывается с ингибитором пепстатином, находящимся в цитозоле, и переходит в неактивный комплекс, который разрушается с высвобо­ждением активного энзима либо при низких pH, либо вследствие отщепления ингибитора проте- иназой Ysc В, локализованной также в лизосомах. Этим объясняется несоответствие в рН-опти- мумах для индукции автолиза (создания при низких значениях pH необратимого дисбаланса анаболических и катаболических процессов за счет активации протеиназы Ysc А) и для реакций последующего разрушения биополимеров, в первую очередь, белков, с участием основных дрож­жевых протеиназ, имеющих pH-оптимум в нейтрально-щелочной области.

Другой процесс, имеющий важное значение для индукции автолиза, — это нарушение струк­турного состояния и функциональной активности ЦПМ, а также мембран внутриклеточных органелл и ЭПР. Изменение жидкокристаллического состояния мембранных липидов в сторону необратимого увеличения их текучести приводит к нарушению барьерных и других функций мембран, вследствие дезорганизации липидной стромы мембраны и нарушений липид-белковых взаимодействий интегрированных и ассоциированных с ней ферментов. Поэтому супраопти- мальная концентрация внеклеточных СНЖК, вызывающая дестабилизацию мембран, является второй самостоятельной причиной индукции автолиза. Закисление инкубационной среды, спо­собствующее более эффективному включению в мембраны протонированных молекул СНЖК, позволяет снизить нормы их расхода для индукции автолиза (табл. 3).

Как следует из приведенных данных, автолиз, индуцированный внесением СНЖК при од­новременном подкислении инкубационной среды, и создание затем оптимальных условий протекания собственно автолитической деструкции клеток позволяют проводить равно глу­бокий гидролиз внутриклеточных биополимеров при использовании индуктора в значитель­но меньшей концентрации (150-200 нМ вместо 600 нМ) и сокращают время автолиза до 4 ч вместо 6 ч.

От среды роста, т.е. стресс,вызванный высокой клеточной плотностью, и лишение клеток источ­ников энергии, что,согласно постулату Вэлча,индуцирует автолитическую деструкцию клеток.

И, наконец, последняя причина развивающихся литических процессов — собственно образую­щийся автолизат, который может служить затравкой и применяться как индуктор, благодаря дей­ствию содержащихся в нем экзогенных (вышедших из клеток в инкубационную среду) гидролаз. Дополнительно к гидролазам в автолизате-затравке действуют и вышедшие из автолизирующихся клеток СНЖК.

В качестве примера использования самой автолизированной суспензии для индукции автолиза рассмотрим процесс гидролитического разрушения биомассы «ожиренных» (выращенных в режи­ме преимущественного накопления липидов) дрожжей R.

в инкубационную среду до 40-45% белка клетки в виде низкомолекулярных соединений, а в ваі антах внесения дополнительного количества индуктора — углубить протеолиз с выходом иепти; до 60-75% от общего белка клеток.

Прием использования отъема автолизата как затравки для индукции автолиза особенно целе< образен при разработке технологии автолиза в непрерывном режиме для получения глубоко гид] лизованных продуктов, обогащенных в основном свободными аминокислотами.

Анализ данных, приведенных в этом разделе, обосновывает вывод о двустадийности как ин; цированного, так и спонтанного автолиза микроорганизмов, где первой стадией является инду ция, регистрируемая по ингибированию энергодающих процессов и падению числа жизнеспосс ных клеток, а второй — собственно автолитическое разрушение клеток, определяемое по выхо в инкубационную среду продуктов деградации биополимеров. Подчеркнем, что эти стадии разл чаются принципиально как по природе и итогу процесса, так и по условиям, оптимальным для дс тижения этого итога.

К параметрам, которые необходимо учитывать на стадии индукции относятся: pH инкубационн< среды; плотность автолизируемой клеточной суспензии; концентрация индуктора и способ его внес ния. Оптимизация этого этапа позволяет существенно (в 2 и более раз) сократить расход индукто; (табл. 3), а также влияет на скорость и глубину автолиза на стадии деградации клеток.

3.4.