Мембранотропные соединения как индукторы автолиза

В настоящее время в решении проблемы автолиза микроорганизмов акцент исследований сме­стился в область изучения сохранности или повреждения клеточных мембран под действием мем- бранотропных соединений, которые обладают эффектами силового нековалентного близкодейст- вия, в результате прямого присоединения (инкорпорации) к отдельным участкам мембраны.

Структурные перестройки оказывают глубокое влияние практически на все формы функцио­нальной активности биологических мембран — каталитическую активность интегрированных мембранных ферментов, барьерную функцию, проницаемость, процессы транспорта ионов, саха­ров, нуклеотидов и других соединений, аэробный и анаэробный энергообмен.

В клетках дрожжей (эукариот) структурные преобразования генерализованного характера, на­чавшись в ЦПМ, распространяются по всей клетке за счет непрерывной сети мембран эндоплазма­тического ретикулюма (ЭПР), и таким образом вся клетка включается в физиологический ответ на внешнее воздействие.

Поэтому часто в качестве индукторов автолиза используют мембранотропные соединения, вы­зывающие общие нарушения структурной организации мембран микроорганизмов и, вследствие этого, их барьерных функций, что приводит к выходу из клетки жизненно важных метаболитов: ионов К⁺, неорганического фосфора, сахаров, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых основа­ний.

Детергентами, или поверхностно-активными веществами (ПАВ), называют довольно значи­тельный ряд синтетических веществ со смешанным типом растворимости молекулы, например, со­держащие гидрофильную группу и длинный углеводородный радикал -— цепочку из 5-20 атомов углерода. ПАВ различаются наличием и характером заряда (анионоактивные, катионоактивные, неиногенные и амфотерные соединения).

К анионоактивным детергентам относят жирные кислоты, их соли (мыла), алкилсульфаты, алкиларилсульфонаты и др. По некоторым данным, эти виды детергентов извлекают липиды и белки из клеточных оболочек, например грамотрицательных бактерий, устойчивых к боль­шинству литических ферментов, и формируют одиночные ионные каналы (как показано на бис­лойных липидных мембранах). В мембранах дрожжей они вызывают уменьшение содержания общих липидов и фосфолипидов и компенсаторное увеличение степени ненасыщенности жир­ных кислот, приводя, в конечном итоге, к критическому повышению текучести мембран и ее де­стабилизации .

В настоящее время довольно хорошо изучена функциональная и дестабилизирующая роль свободных жирных кислот в мембране. Как выяснилось, они обеспечивают регулируемое разоб­щение дыхания и окислительного фосфорилирования в ЦПМ прокариот и мембранах митохонд­рий эукариот. Механизм разобщающего действия свободных жирных кислот обусловлен их фи­зическими свойствами — в целиком протонированном виде проходить через липидную строму мембраны и на ее внутренней стороне обменивать свой протон на моновалентный ион К⁺, т.е. проявлять ионофорную активность. Следствием этих свойств свободных жирных кислот являет­ся их способность существенно изменять поверхностный заряд мембран, снижая протонный гра­диент, что не может не сказаться на функциях мембран и, в частности, на трансмембранном пе­реносе ионов.

Если ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты в равной степени индуцируют мембран­ную проницаемость для моновалентных ионов, то свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК), кроме того, увеличивают степень текучести мембранных липидов.

Существенно, что СНЖК в высокой концентрации вызывают дестабилизацию мембран. Меха­низм такого действия заключается в способности СНЖК растворяться в мембране без участия ацилпереносящего белка и снижать температуру плавления мембранных липидов, что ведет к уве­личению текучести мембраны. Наиболее эффективными оказываются те ненасыщенные жирные кислоты, которые обладают собственной низкой температурой плавления. При этом увеличение текучести мембраны сверх некоторого предела оказывается летальным для клеток и является при­чиной их автолиза.

Среди катионных детергентов — четвертичных солей аммония и пиридиновых соединений — наиболее изучены цетилтриметиламмоний хлорид и цетилпиридиний хлорид. Эти детергенты с трудом отмываются от клеток после совместной инкубации. Полагают, что микробная клетка поглощает значительно большее количество детергента, чем может уместиться на ее поверхности в виде мономолекулярного слоя. Соединения этого класса, например соли алкилтриметиламмо- ния, индуцируют автолиз клеток различных микроорганизмов за счет взаимодействия с мембра­ной. Благодаря гидрофобности молекул детергента, происходит их интеркаляция в липидный бислой, что приводит к разупорядочению липидных компонентов бислоя, вызывает нарушение барьерных функций мембран и приводит к гибели клетки.

Вещества, относящиеся к типу неионных детергентов, обычно имеют в гидрофильной части мо­лекулы одну или несколько гидроксильных, оксиметильных или оксиэтиленовых групп (твины и тритоны). Их антимикробная активность невелика, хотя они обладают способностью изменять стру­ктуру клеточной оболочки микробной клетки, высвобождая белки, липополисахариды, липиды, угле­воды, зольные элементы. Это ведет к повышению проницаемости ЦПМ и увеличению пор в клеточной стенке, что повышает степень лизиса клеток при их обработке ферментами или антибиотиками.

Амфотерные соединения, полученные из высокомолекулярных аминов конденсацией с окисью этилена и последующим сульфатированием или взаимодействием с хлоруксусной кислотой, в изо­электрической области ведут себя как неионогенные вещества, в щелочной — как анионогенные, в кислой — как катионоактивные.

В качестве индукторов автолиза возможно применение комплексонов — алкилпроизводных иминополикарбоновых кислот, например этилендиаминтетраацетата(ЭДТА), которые повышают пассивную проницаемость мембран за счет связывания ионов металлов (в частности Mg^2t), обра­зующих меж- и внутримолекулярные поперечные сшивки между фосфатными группами липо­протеидного и липополисахаридного компонентов клеточной оболочки и обеспечивающих их структурную стабильность. Поверхность клетки при этом подвергается стерическим или химиче­ским изменениям, для репарации которых необходима энергия, а если ее не хватает — начинает­ся автолиз.

Довольно широко в научных экспериментах и в практических технологиях используют орга нические растворители, которые действуют на ЦПМ, растворяют гидрофобный липидный ма-

210 Часть И. Примеры применеии» биотехнологии БАВ и науке и нроизиолстне

трикс и вызывают солюбилизацию белков и липополисахаридов. Таков механизм действия толу­ола, бутанола, фенетилалкоголя, тетраметилмочевины, N-метилпирролидона, диметилсульфо- ксида, сурфинола, триамида, гексаметилфосфорной кислоты. Местом приложения действия алканов являются гидрофобные участки мембраны, и эффект действия (в ряду этанол, изопропа­нол, бутанол) зависит от растворимости в них мембранных липидов.

Все описанное выше многообразие механизмов структурных перестроек мембран нод действием мембранотропных соединений можно свести к нескольким схемам воздействия:

• структурная перестройка локального участка мембраны -» изменение проницаемости * индуцированная изменением концентрации вещества (глобальная) генерализованная структурная модификация мембраны -» функциональные изменения;

• структурная перестройка локального участка мембраны -» активация ферментов -» вто­ричные структурные возмущения продуктами катализа;

• изменение электрохимического градиента -* структурная перестройка -» функциональ­ные изменения.

Для теории и практики индуцированного автолиза представляется перспективным углублен­ное изучение особенностей взаимодействия детергентов с различными мембранными компонента­ми. Новую информацию могут дать в этом отношении современные физико-химические методы регистрации конформационных переходов компонентов мембран совокупно с определением пока­зателей растворимости мембранных липидов и температуры их фазовых состояний.

Широкое использование различного рода описанных выше химических соединений в качестве индукторов автолиза с целью получения крупных опытных и промышленных партий автолиза­тов кормового и пищевого назначения существенно ограничивается необходимостью их после­дующей очистки от вносимого индуктора. Проблема целенаправленного подбора нетоксичных высокоэффективных индукторов автолиза и разработки условий наиболее интенсивного осуще­ствления процесса автолитического разрушения клеток микроорганизмов может быть успешно решена путем изучения природных процессов, контролирующих активность автолитических ферментов в физиологических, естественных для микроорганизмов, условиях, изучения хими­ческой природы метаболитов, обладающих ауторегуляторными функциями, а также механиз­мов их действия. Рассматривая различные подходы к решению проблемы индуцированного ав­толиза, обратим внимание на то, что до сих пор обсуждались механизмы индукции автолиза и регуляции интенсивности автолитических процессов, основанные на действии внешних фак­торов. Однако существуют и собственные регуляторные факторы — микробные ауторегулято­ры, которые в зависимости от их концентрации в культуре контролируют интенсивность авто­литических процессов и уровень которых меняется в клетках различного физиологического возраста.

К числу таких ауторегуляторов относятся синтезируемые микроорганизмами различных таксономических групп внеклеточные факторы d₂ (фб₂), обладающие видонеспецифическим (однотипным) характером действия на клетки различных микроорганизмов. Факторы d₂, ак­тивным началом которых являются свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК), влияют на фазовое состояние мембран.

С этих позиций фб₂ можно считать эндогенными индукторами автолиза микробных клеток в постстационарной фазе отмирания клеток микробных культур.

Универсальность химической природы и механизмов действия фй₂, представленных у микро­организмов разных таксономических групп свободными жирными кислотами, обусловила возможность и целесообразность использования выявленных фундаментальных закономерностей природной регуляции активности автолитических процессов для разработки технологий индуци­рованного автолиза микроорганизмов.

Рассмотрим методологические подходы и методические приемы создания высокоэффективных технологий получения автолизатов микроорганизмов на примере разработки промышленных способов автолиза дрожжей, с использованием в качестве индуктора автолиза химических анало­гов микробных ауторегуляторов фс1₂ — свободных ненасыщенных жирных кислот.

3.