Индукторы автолиза

Индукторы автолиза — факторы, вызывающие нарушения целостности клеточной оболочки, в зависимости от природы воздействия подразделяются на физические, химические и биологиче­ские.

Из физических факторов — это, прежде всего, влияние температуры, например резкое изме­нение оптимальной температуры роста или попеременное замораживание и оттаивание. В первом случае развитие автолитических процессов — это результат стресса, обусловленный неподготов ценностью клетки к адаптивным структурным изменениям в клеточных мембранах, приспосабли­вающим клетку к новым условиям. Во втором — причиной является механическое повреждение всех органоидов клетки, в том числе мембран, кристалликами образующегося льда.

Температура влияет не только на индукцию автолиза, от нее зависит и скорость последующей деградации клетки, причем автолиз дрожжевых клеток обычно интенсивен в интервале от 40 до 58 °С. Например, прогревание дрожжей шампанской расы при 40 °С в течение 2 суток приводит к полно­му автолизу клеток, при этом резко возрастает содержание внутриклеточных липидов, разруша­ются ядерные, вакуолярные и хондриосомные структуры; почти полностью исчезает волютин и уменьшается содержание гликогена. Термообработка при отсутствии кислорода повышает актив ность дрожжевых автолизинов (ферментов, разрушающих биополимеры обработанных при 40 °С клеток в течение 3 ч при 65 °С приводит к уменьшению содержания маннана. Автолиз, сопровож­дающийся резким повышением проницаемости клеточных оболочек, в первую очередь ЦПМ, при­меняется в промышленности для повышения эффективности получения микробных БАВ. Так име ются сведения о практически 100 % экстракции лизина в водную среду при термообработке кле­точных суспензий продуцента Candida utilis при 60-70 "С в течение 30 мин, приводящей к автоли тическому разрушению клеточных мембран.

Другим важным фактором, оказывающим влияние не только на индукцию автолиза, но и на раз­витие всего процесса, является осмотическое давление среды.

Однако ряд микроорганизмов обладает механизмами осмозащиты. Например, повышение осмоти­ческого давления в среде осмофильных дрожжей Rhodotorula glutinis (2-10% NaCl) приводит к сниже­нию содержания в клетках липидов и полисахаридов и увеличению полиолов. Последние выполняют функции осмопротекторов, стабилизирующих структуру ферментов и, таким образом, предупрежда­ющих их денатурацию в условиях повышенного осмотического давления. Эти свойства осморегулято­ров могут найти применение в практических целях.

Глубокие изменения в биосинтетических процессах клеток могут быть вызваны иррадиацией луча ми высокой энергии и высокой проникающей способности: ультрафиолетовым (УФ) и у-облучением. Установлен синергизм индуцирующего автолиз воздействия лучей дальнего УФ и повышенной (по сравнению с физиологическим оптимумом) температуры, приводящий к увеличению скорости разру­шения дрожжевых клеток на 50% .

Наконец, механическое разрушение клеточных стенок бактерий, грибов и дрожжей приводит к на­рушению компартментализации автолитического ферментного комплекса, а у дрожжей и грибов — к высвобождению, кроме того, лизосомальных протеаз, что обеспечивает субстрат-ферментные взаи­модействия автолитических гидролаз с компонентами мембраны и биополимерами клеточной стенки, приводящие к их разрушению.

Автолиз может быть вызван химическими индукторами. Экстремальные изменения ионной силы раствора, pH и качественного состава ионов в среде вызывают многосторонние эффекты, приводя­щие к летальным изменениям метаболической активности клеток. Содержание ионов в среде, особен­но бивалентных катионов, оказывает существенное влияние, помимо индукции, также и на скорость автолиза. Считают, что большинство литических ферментов более активны при низкой ионной силе раствора. Для яичного лизоцима, например, в зависимости от pH она колеблется от 0,05 до 0,12.

При добавлении небольших количеств нейтральных солей (0,2 М NaCl или MgCl₂) к водной сус­пензии бактериальных клеток отмечается некоторое увеличение оптической плотности суспензии при уменьшении объема клеток Е. coli на 15 % , а протопластов — на 28,7 %, что объясняется эла­стичностью пептидогликанового (ПГ) слоя за счет подвижности связей в пептидных субъединицах и полисахаридных цепях. Если при низкой ионной силе раствора подкисление приводит к сокраще­нию объема громадной молекулы ПГ, то в растворах с высокой ионной силой электростатические взаимодействия выражены слабо (заряженные группы экранированы), молекула ПГ растягивается и объем ее мало зависит от pH. Компактность ПГ влияет на скорость его деградации экзофермента­ми — увеличение компактности приводит к возрастанию эффективности фермент-субстратного вза­имодействия.

Помимо величины ионной силы инкубационной среды на автолитические процессы существен­но влияет качественный состав ионов. Высокие концентрации галогенов в солях NaCl, NaBr, КС1, NH₄C1 специфически активируют ферменты автолитического комплекса. Считают, что ион хлора, связанный с одновалентным катионом малой плотности заряда (Аа⁺, К⁺, NH_t⁺), действует как хао- тропный ион, способствуя дезорганизации липидов мембран, солюбилизации автолизинов и их связыванию с материалом клеточной оболочки.

Соли одновалентных катионов, щелочноземельных металлов, кобальта и марганца оказывают незначительное влияние на интенсивность автолиза. Соли меди, железа и цинка в концентрации 0,2-0,5 мМ подавляют процесс, а ионы Са²⁺ или Mg^z+ в концентрации 10 мМ стабилизируют кле­точные биополимеры и предотвращают повреждения субклеточных структур. По другим данным, двухвалентные катионы способствуют увеличению проницаемости клеточных мембран. Отмечают неоднозначное влияние ионов на интенсивность автолиза в зависимости от состава среды. Напри­мер, на среде с глюкозой в присутствии ионов кадмия в концентрации 0,05 мМ число жизнеспособ­ных клеток S.

На структурную целостность клеточных оболочек и функциональную активность мембран оказы­вают выраженное действие такие биологические индукторы автолиза, как некоторые аминокисло ты, белки и ферменты, модифицирующие или частично разрушающие биополимеры клеточной обо­лочки. Значительный индуцирующий автолиз эффект вызывается добавлением к нативной культу-

208 Часть И. Примеры применения биотехнологии БАВ в науке и производстве

ре микроорганизмов самого авто лизата или фракций клеточных гидролизатов. При этом некоторые аминокислоты, наоборот, являются ингибиторами автолиза. Например, глицин, аланин, норлейцин, фенилаланин, метионин и пролин в концентрациях 10 ³ — 10 ⁵ М повышают верхний предел темпе­ратуры повреждения мембран дрожжевых клеток на весьма значительную величину — 3 -9 ’С. Эффе­ктивность протекторного действия, определяемая расстоянием между отрицательно и положительно заряженными группами и гидрофобным компонентом молекул аминокислот и олигопептидов, убы­вает в такой последовательности: дипептиды а-аминокислот, а-аминокислоты, (3-аминокислоты, трипептиды. Отмечена зависимость тормозящего автолиз эффекта от степени гидрофобности амино­кислот. В случае наиболее гидрофобных аминокислот ингибирование снимается, что, по-видимому, объясняется непосредственным взаимодействием последних с липидными компонентами клетки.

Существенное влияние на индукцию автолиза оказывают некоторые антибиотики, влияющие на синтетазную и деполимеразную активности системы синтеза клеточной стенки.

С позиций биохимического и физиологического дисбаланса клеточного метаболизма можно рас­сматривать и изменения концентрации кислорода в среде: удаление кислорода из активно расту­щих аэробных культур или, напротив, аэрирование среды роста анаэробов. Наиболее широко пред­ставлен физиологический тип индукции автолиза, который обусловлен голоданием или ограниче нием источников питания и энергии, например, при переносе культуры в бедный солевой раствор. На автолиз, вызванный перенесением клеток в буферные растворы, существенное влияние оказы­вает природа буфера. Так, ацетатный и боратно-цитратный буферы снижают скорость и интенсив­ность автолиза Bacillus cereus, Myxococcus xanthus, Streptococcus faecalis, а фосфатный буфер ус­коряет процесс.

2.2.