Регистрируемые параметры автолиза

Первой характеристикой необратимости автолитической деградации и гибели клеток является потеря ими жизнеспособности, что определяется как резкое снижение численности колониеобра­зующих единиц (КОЕ) при высеве проб автолизирующейся суспензии на плотные питательные сре­ды (в случае автолиза дрожжей — на сусло-агар).

О дальнейших изменениях, происходящих в процессе автолиза, можно судить по измене­нию реологических свойств клеточной суспензии. На начальных стадиях автолиза происходят прежде всего изменения, связанные с разрушением клеточных оболочек: необратимая струк­турная дезорганизация ЦПМ и потеря ею барьерной функции; падение тургора клетки, вслед­ствие диффузионного выхода из нее ионов и ряда низкомолекулярных соединений; уменьше­ние за счет этого размеров клетки. Эти события обусловливают изменения вязкости клеточной суспензии.

В следующей фазе происходит гидролитическое расщепление клеточных биополимеров, раз­рушение внутриклеточных структур и высвобождение продуктов гидролиза в инкубационную среду. Клеточная стенка во время автолиза эндотипа подвергается определенным модификаци­ям, и, хотя она разрыхляется и частично гидролизуется, целостность ее сохраняется. У микро­организмов с экзотипом автолиза клеточная стенка разрушается полностью. Подчеркнем, что необходимым условием автолитической деструкции клетки является полное разрушение цито­плазматической мембраны. У дрожжей автолиз протекает по эндотипу и начинается с разруше­ния ЦПМ. У некоторых грибов, обладающих высокой активностью эндо- и экзоглюканаз, име­ет место экзотип автолиза и наблюдается полное разрушение не только мембраны, но и клеточ­ной стенки.

О развитии автолитических процессов часто судят по падению оптической плотности клеточ­ных суспензий. Однако более корректно характеризовать автолиз по биохимическим показате­лям: высвобождению в инкубационную среду продуктов деградации клеточных биополимеров и снижению их исходного содержания в клетке, например, уменьшению количества внутрикле­точного белка параллельно с увеличением количества продуктов его гидролиза в инкубацион­ной среде.

Характеристиками автолиза служат интенсивность процесса и глубина распада клеточных структур.

Интенсивность автолиза определяется скоростью реализации продуктов гидролиза клеточных биополимеров и как суммарный ферментативный процесс зависит от:

• количества гидролаз;

• активности гидролаз;

• физико-химических условий среды;

• субстратной устойчивости клеточных компонентов к действию ферментов автолитическо­го комплекса.

Глубина автолиза измеряется соотношением общего количества имеющихся в клетке до авто­лиза биополимеров (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) и их гидролизовавшейся частью. Глубина и скорость автолиза зависят от физиологического возраста клеток. Клетки экспо­ненциально растущей культуры автолизируются быстрее и в большей степени, чем клетки стаци­онарные, полного саморастворения которых, как правило, добиться не удается. Это объясняется тем, что наиболее интенсивно ферменты автолитического комплекса синтезируются в клетках экс­поненциальной фазы роста, где они принимают участие в важнейших физиологических процессах, таких как рост и деление клеток. Зависимость автолиза от возраста связана не только с количест­вом имеющихся в клетке ферментов автолитического комплекса, но и с их активностью, что обу­словлено изменением конформации ферментов и физико-химических условий в стареющих клет­ках. Например, маннаназы в стационарных клетках дрожжей менее активны, чем в экспоненци­альных.

При разработке технологий автолиза важно учитывать последовательность событий, приводя­щих к деструкции микробных клеток. Прежде всего, это относится к разграничению этапов индук­ции автолиза и собственно автолитического разрушения клеточных биополимеров, различающих­ся как по целевой направленности происходящих на этих этапах процессов, так и по условиям, определяющим их развитие. Индукция автолиза предусматривает создание дисбаланса между процессами синтеза и деградации клеточных структур. Ее результативность определяется харак-

Табл. 1. Влияние коммерческих препаратов жирных кислот на дыхание интактных клеток фазы линейного роста дрожжей R.aurantlaca

тером выбранного индуктора и физико-химическими условиями, оптимальными для лишения клетки энергии или нарушения структуры клеточной оболочки.

Для получения необходимой информации об эффективности этапов автолиза целесообразно проводить исследования временных характеристик (динамики) клеточной деструкции, которые дают возможность определить сроки интенсивного развития процесса, а также временные интер­валы для корректировки физико-химических параметров среды для поддержания высокой скоро­сти гидролиза клеточных биополимеров.

3.2. Выбор индуктора

Выбор эффективного индуктора является первой технологической задачей. В этом отношении предпочтение следует отдать СНЖК, т.к., во-первых, они являются естественным компонентом клетки и поэтому нет необходимости удалять их из полученного продукта — автолизата; во-вто­рых, они производятся из возобновляемого сырья и потому достаточно дешевы и доступны.

Хорошим биологическим тестом для подбора индуктора является определения его влияния на дыхание клеток, так как этот показатель количественно отражает изменения функциональной ак­тивности мембран, обусловленные нарушениями их структурной организации, что, как было ска­зано выше, является причиной автолиза. Эндогенное дыхание клеток измеряют полярографиче­ски в кислородной ячейке конструкции Шольца-Островского.

Биологическое тестирование коммерческих препаратов индивидуальных жирных кислот пока­зывает, что в основном за физиологическое действие — ингибирование дыхания и индукцию авто-

Рис. 1. Влияние пальмитиновой (I ), стеариновой (2), олеиновой (3), линолевой ( 4 ) кислот в концентрации 600 нМ/мл на дыхание клеток fLauratiaca (Л) и S.serei’isi'uc ( Ц /

Табл. 2. Индукция автолиза суспензии дрожжей S.cerevisiae (МСК 12%) коммерческими препаратами жирных кислот

лиза клеток — ответственны ненасыщенные жирные кислоты (табл. 1), хотя все испытанные жир- ные кислоты в концентрациях более 300 нМ/мл вызывают ингибирование эндогенного дыхания клеток дрожжей R.aurantiaca.

Высокие концентрации СНЖК (200-800 нМ/мл), приводя к сверхкритическому увеличению жидкостности клеточных мембран, вызывают ингибирование дыхания клеток любой фазы роста. Повышение концентрации до 1000 нМ/мл и более не приводит к ускорению или увеличению сте­пени ингибирования дыхания клеток, видимо, из-за эффекта мицеллообразования вокруг клетки за счет избытка жирных кислот.

Эффект ингибирования дыхания развивается во времени (рис. 1). Степень ингибирования дыха­ния клеток дрожжей под воздействием отдельных жирных кислот различается значительно: через 10 мин после внесения в клеточную суспензию отмечается подавление дыхания дрожжей олеино­вой кислотой на 62%, линолевой — на 61%, пальмитиновой — на 29%, стеариновой — на 18%. Коммерческие препараты ненасыщенных жирных кислот в концентрациях, подавляющих дыха­ние клеток дрожжей, эффективно индуцируют автолиз (табл. 2).

Различия в дестабилизирующем мембраны действии различных жирных кислот (измене­ние фазового состояния мембран) связаны с разницей в температурах их плавления — более низких у ненасыщенных ЖК: стеариновая кислота — 69,6 ”С, пальмитиновая — 63,1 ’С, олеи­новая — 13,5 “С, линолевая — минус 5 °С. Кроме того, повышение степени ненасыщенности мембранных липидов коррелирует с увеличением проницаемости мембран, а повышение кон­центрации СНЖК вызывает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования. Сум­марные модификационные изменения структурных и функциональных свойств мембран, вы­званные дестабилизирующим действием ненасыщенных ЖК, играют драматическую роль в развитии патологических процессов, одним из которых является автолиз клеток, завершаю­щийся их гибелью.

Рис. 3. Влияние препарата СНЖК на эндогенное дыхание клеток R. auratiaca (1 ) и S. cerevisiae (2) линейной фазы роста в зависимости от pH среды (0.15 .М фосфат цитратный буфер, концентрация СНЖК 30 мкг/мл )

Рис.

Рис. 4. Влияние препарата СНЖК на эндогенное дыхание клеток R. aurati- аса линейной фазы роста в зависимости от концентрации клеточной сус пензии (концентрация СНЖК 80 мкг!мл ) )

Биологические тесты влияния на дыхание клеток целесообразно использовать и для определения эффективности действия и подбора доз индуктора. Сравнительный анализ действия коммерческих препаратов ненасыщенных жир­ных кислот показывает общие за­кономерности их эффектов. Для всех СНЖК степень ингибирова­ния дыхания клеток повышается при: увеличении концентрации вносимых липидов (рис. 2), сниже­нии pH инкубационной среды (рис. 3), уменьшении количества биологического материала в ячей­ке (рис. 4), а также развивается во времени (рис. 1) и зависит от фи­зиологического возраста клеток (рис. 2, 5).

Рис. 5. влияние препарата СНЖК и олеиновой кислоты па дыхание клеток периодичес кой культуры fi.au rat iaca 1 - кривая роста, ОН (600 нм); 2 - удельная скорость роста дрожжей (р), ч '^}; 3 - дыхание клеток при добавлении препарата СНЖК (80 мкг/мл клеточной суспензии );

4 — дыхание клеток при внесении олеиновой кислоты (600 нМ/мл клеточной сиспен .ши )

Обратим внимание, что на рис. 2 и 5, характеризующих влияние свободных жирных кислот на дыхание клеток различного физиологического возраста, имеется существенное различие в их действии на клетки экспоненциальной, линейной и стационарной фаз роста. Во-первых, только у клеток линейной фазы роста или более старых отмечается стимуляция дыхания при низких кон­центрациях СНЖК, в то время как у экспоненциально растущих клеток эти дозы вызывают ингибирование дыхания и индуцируют автолиз. Во-вторых, степень ингибирующего действия сни­жается по мере старения микробной культуры.

Эффект стимуляции дыхания объясняется двояко: протонофорным действием СНЖК, кото­рые, в отличие от классических протонофоров, обнаруживают это свойство, когда, пройдя через митохондриальную мембрану, обменивают протон карбоксильной группы на внутрикле­точный калий, а также способны в значительной степени снижать электрическое сопротив­ление мембран, что совокупно приводит

к нарушению электрического трансмемб­ранного потенциала и компенсаторному увеличению дыхания при разобщении с биоэнергетическими процессами. Другое объяснение относится к способности СНЖК повышать текучесть мембран и, следовательно, активность интегрирован­ных в них ферментов.

Липиды мембран клеток экспоненци­альной фазы роста в наибольшей степени обогащены ненасыщенными ЖК, т. е. обла­дают мембраной, текучесть которой при­ближается к максимально возможной, что и определяет максимальную физиологиче­скую активность клеток этой фазы роста, но также и максимальную их чувствитель­ность к индукторам автолиза, поскольку даже незначительное повышение текучести липидов в их мембранах является сверх­критическим.

Отсюда следует важный вывод, что если наибольшей чувствительностью к дейст­вию СНЖК обладают клетки экспоненци­альной и линейной фаз роста, то в работе с непрерывными культурами необходимые дозы индуктора автолиза при высоких ско­ростях протока должны быть значительно меньше, чем требующиеся для автолиза клеток стационарных фаз роста периодических культур. Этот вопрос будет рассмотрен далее более подробно.

Нужно отметить, что, хотя в тестах на дыхание клеток дрожжей определяется действие СНЖК на функциональную активность митохондриальных мембран, но и ЦПМ дрожжевой клетки, и мембраны ЭПР, и множество других клеточных структур, оформленных при участии мембран (в том числе лизосомы), также являются мишенью для действия свободных жирных кислот.

При разрушении мембран лизосом под действием СНЖК начинается неконтролируемое расще­пление макромолекул и клеточных структур под действием лизосомальных гидролаз, которое за­канчивается гибелью клетки.

Естественно, что, обладая протонофорным действием, СНЖК проявляют большую активность в подкисленной среде, находясь в протонированном состоянии (рис. 3), что может быть использо­вано для снижения норм их расхода при индукции автолиза. Также следует обратить внимание на зависимость ингибирования дыхания жирными кислотами от плотности клеточной суспензии (рис. 4), что также должно учитываться при расчетах эффективных доз индуктора и будет более подробно рассмотрено ниже.

Таким образом повышение уровня СНЖК в клеточной суспензии влияет на энергетическую функцию (дыхание) и фазовое состояние мембран вплоть до их дестабилизации, что является побу­дительной причиной автолиза клеток микроорганизмов различных таксономических групп, как про-, так и эукариот.

Результаты, свидетельствующие о видонеспецифичности действия СНЖК как эффективного индуктора автолиза; промышленном производстве препаратов СНЖК; нетоксичности этих соединений, благодаря чему их не требуется удалять из конечного продукта, — позволяют ре­комендовать СНЖК для технологий автолиза микроорганизмов в качестве универсального индуктора.

3.3.