Введение

Практикум предназначен для студентов 3-4 курсов, специализирующихся в области молекулярной биологии, генетики, вирусологии и смежных специальностей. На примере клонирования полноразмерной кДНК гена флуоресцентного белка отрабатывается ряд методов, широко применяемых в современной генной инженерии, в том числе выделение тотальной РНК, обратная транскрипция и амплификация кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР), поиск и клонирование участков интересующего гена с применением вырожденных праймеров, поиск генов в экспрессионной библиотеке, экспрессия.

Общие рекомендации и замечания

1. Практикум разбит на несколько задач, которые могут быть выполнены как в представленной ниже последовательности, так и по отдельности (за исключением задачи 5) - в зависимости от объема выделяемого на практикум учебного времени, наличия специального оборудования.

2. Перед началом лабораторной работы следует проверить наличие всех необходимых для выполнения практикума реагентов и оборудования.

3. До начала практикума рекомендуется провести тестовое выполнение задач опытным сотрудником, чтобы убедиться, что реактивы не испортились в процессе транспортировки или хранения.

Основные задачи практикума

Задача 1. Выделение суммарной РНК. Анализ суммарной РНК электрофорезом в агарозном геле. Время выполнения - 1 день

В рамках практикума предлагается выделение РНК из фиксированных в RNA-Later (тризоле) фрагментов тела кораллового полипа Clavularia sp. Однако для выделения РНК можно также использовать другие доступные объекты (например, любое насекомое, икра рыб, улитка из аквариума и пр., кроме растений^[1]).

Выполнение данной задачи демонстрирует базовые приемы работы в молекулярно-генетической лаборатории, семинар по теме дает представление о способах выделения нуклеиновых кислот из разных биоматериалов, процессах, происходящих с компонентами биоматериала на каждом этапе выделения.

Задача 2. Синтез кДНК на матрице суммарной РНК. Время выполнения - 1-2 дня

Задача посвящена приготовлению амплифицированной кДНК методом синтеза со сменой матрицы (template switching cDNA synthesis). Качество полученной кДНК контролируют с помощью гель-электрофореза.

В качестве стартового материала может быть использована РНК, полученная при выполнении задачи 1, или контрольная РНК Clavularia из Набора для практикума (Евроген).

В данной задаче учащиеся узнают о некоторых генно - инженерных методах и инструментарии, используемом в молекулярной генетике.

Задача 3. Амплификация 3'-концевого участка кДНК гена флуоресцентного белка из кораллового полипа Clavularia (3'- RACE). Время выполнения - 1-2 дня

В рамках практикума проводятся два -три последовательных раунда амплификации 3'-концевого фрагмента кДНК флуоресцентного белка из кораллового полипа Clavularia методом

Nested ПЦР/Step-out RACE. Для амплификации используют ген­специфические праймеры. Использование вырожденных праймеров

для решения задачи, когда известна только аминокислотная последовательность целевого транскрипта, обсуждено в разделе

2.4.3.

В качестве стартового материала может быть использована кДНК из Clavularia, полученная при выполнении задачи 2, или контрольная кДНК из Набора для практикума (Евроген).

В результате выполнения задачи должен быть получен гомогенный (если нет вариантов с альтернативным сплайсингом, либо высокогомологичных аллелей, различающихся размером 3'- нетранслируемой области) продукт ПЦР длиной около 550 п.н., соответствующий 3'-концевой последовательности мРНК. Такой результат можно считать успешным завершением работы.

В рамках этой задачи отрабатывается один из основных генно­инженерных методов - ПЦР, на семинаре обсуждаются его особенности и модификации, способы применения для современных исследований.

Внимание! Клонирование и секвенирование продукта 3'-RACE, а также вся процедура клонирования 5'-концевого фрагмента транскрипта (5'-RACE) выведены за рамки практикума. 5'-RACE рассмотрен только теоретически (см. раздел 2.4.4).

Задача 4. Амплификация полной кодирующей

последовательности гена флуоресцентного белка из Clavularia. Направленное клонирование в бактериальный экспрессирующий вектор. Экспрессия флуоресцентного белка в E.coli и отбор целевых клонов. Время выполнения - 3-5 дней

Задача посвящена амплификации и сайт-направленному клонированию в экспрессионный вектор полной кодирующей последовательности гена флуоресцентного белка Clavularia. Вектор используют для химической трансформации бактерий. После наращивания бактерий выявляют клоны, продуцирующие флуоресцентный белок. Подтверждением успешного выполнения работы является положительный результат контрольной ПЦР. При работе над этой задачей учащиеся закрепляют навыки постановки ПЦР, учатся рассчитывать и проводить реакцию лигирования, приобретают представление о полном цикле процедуры клонирования от стадии амплификации до получения отдельного клона с последующим выделением плазмидной ДНК.

В качестве стартового материала может быть использована разведенная кДНК из Clavularia, полученная при выполнении задачи 2, или разведенная в 10 раз контрольная кДНК из Набора для практикума (Евроген).

Задача 5. Выделение рекомбинантного флуоресцентного белка. Время выполнения - 2 дня

В качестве дополнительной предложена биохимическая задача по очистке рекомбинантного белка методом металлоаффинной хроматографии. В качестве стартового материала могут быть использованы полученные на предыдущем этапе колонии, экспрессирующие рекомбинантный флуоресцентный белок.

1.