Содержание

Введение 5

Общие рекомендации и замечания 5

Основные задачи практикума 6

1. Необходимые реактивы и оборудование 9

1.1. Компоненты, входящие в Набор для практикума (Евроген) 9

1.2.

практикума 11

1.3. Оборудование 13

1.4. Расходные материалы 13

2. Теоретическая часть 14

2.1. Выделение РНК (задача 1) 15

2.2. Оценка качества суммарной РНК (задача 1) 16

2.3. Синтез кДНК на матрице суммарной РНК (задача 2) 17

2.4. Выявление 3'- и 5'-концевых фрагментов целевых

транскриптов (задача 3) 20

2.4.1. Амплификация 3'-концевых фрагментов кДНК, 3'-Race 20

2.4.2. Nested ПЦР и Step-out ПЦР 23

2.4.3. Дизайн вырожденных праймеров 26

2.4.4. Амплификация 5'-концевого фрагмента кДНК, 5'-Race 29

2.5. Амплификация полной кодирующей последовательности

целевого гена. Клонирование и экспрессия гена флуоресцентного белка в бактериальной системе экспрессии (задача 4) 29

2.5.1. Подбор структуры праймеров и амплифицикация ДНК

для последующего клонирования 30

2.5.2. Выбор системы экспрессии 32

2.5.3. Клонирование 32

2.5.4. Трансформация 34

2.5.5. Отбор клонов, несущих рекомбинантные плазмиды 35

2.6. Очистка рекомбинантного белка (задача 5) 35

2.6.1. Культивация биомассы и индукция промотора 36