Ответ сетчатки глаза на введение метилнитрозомочевины

Однократное введение мышам метилнитрозомочевины (70 мг/кг) вызывает деструктивные изменения в сетчатке глаза, затрагивающие главным образом слой фоторецепторных клеток (рис. 9A).

Доза МНМ 70 мг/кг монотонно и необратимо снижает амплитуду ЭРГ мышей (рис. 10). Цитотоксический эффект МНМ имеет резкую концентрационную зависимость: инъекция мышам МНМ в дозе 35 мг/кг не вызывает изменений в фоторецепторном слое сетчатки (см. рис. 9А) и не сопровождается увеличением экспрессии проапоптотических белков. Однако эта доза вызывает обратимое снижение амплитуды ЭРГ (см. рис. 10).

Таким образом, особенностью ответа сетчатки на генотоксический стресс, вызванный как облучением, так и МНМ, является нелинейность зависимости цитотоксического ответа от дозы, т.е. для этих видов воздействия в сетчатке глаза обнаруживается высокий генотоксический порог. В случае пролиферирующих клеток генотоксический порог связывают с активной системой репарации ДНК.

2. Адаптивный ответ сетчатки глаза на введение метилнитрозомочевины и облучение ускоренными протонами

В предыдущих экспериментах продемонстрирована способность клеток сетчатки к восстановлению структуры ДНК от генотоксических повреждений: спустя 24-48 ч после инъекции ретинотоксической дозы МНМ (70 мг/кг) наблюдалось удаление дефектов и восстановление ДНК (рис. 11Б). Однако несмотря на полную

Рис. 9. Ответ сетчатки глаза у мышей на однократную инъекцию мышам метилнитрозомочевины в двух дозах (35 и 70 мг/кг)

А - микрофоторафия интактной сетчатки (К) и сетчатки через 6 дней после инъекции МНМ; Б - доля (%) фрагментированных ядер фоторецепторов в интактной сетчатке (1) и через 6 суток после инъекции МНМ (2); В - средняя толщина ядерного слоя фоторецепторов интактной сетчатки (1) и через 6 суток после инъекции МНМ (2); Г - иммуноцитохимическое определение экспрессии про- апоптотических белков спустя 24 ч после инъекции МНМ (1- контроль, 2 - МНМ 70 мг/кг)

репарацию, происходила деструкция сетчатки, гибель фоторецепторов и необратимая утрата функций.

Рис. 10. Влияние МНМ на амплитуду ЭРГ у мышей спустя разное время после однократного введения агента животным в дозах 35 мг/кг (серые столбцы) и 70 мг/кг (черные столбцы)

нецитотоксической дозы МНМ 35 мг/кг (см. рис. 10). В силу сказанного в последующих экспериментах мы использовали клеточную гибель/выживаемость и функциональную активность (ЭРГ) как показатели восстановления сетчатки глаза после генотоксического воздействия.

Тактика эксперимента основана на фракционировании дозы агента и используется в токсикологии для характеристики адаптации организма к токсическому агенту (Anderson et al., 2005; Otani et al., 2012). Предполагается, что первое неток-

Рис. 11. Динамика репарации ss,3HK в сетчатке глаза у мышей

А - у мышей, облученых ускоренными протонами в дозе 25 Гр (1 - лизис с добавлением про- теиназы К, 2 - лизис без протеиназы); Б — после инъекции мышам МНМ в дозе 70 мг/кг (лизис с протеиназой)

сическое воздействие в низкой дозе, создает «защитный фон» в ткани, на котором последующее воздействие в высокой дозе становится менее токсичным. Этот эффект в литературе называется гормезисом (Luckey, 2006). Исследования состояли из двух серий экспериментов. В первой серии в качестве адаптирующего воздействия использовали низкую дозу МНМ (химический гормезис).

Рис. 12 представляет схему (А) и результат (Б) опыта по адаптивному ответу сетчатки глаза мышей на последовательное воздействие МНМ сначала в нетоксической (17 мг/кг) и спустя 4 ч в токсической дозе 70 мг/кг. На этом рисунке результат представлен в виде профилей ЭРГ (А) и гистограммой амплитуд ЭРГ (Б).

Адаптивный ответ по активации глиальных Мюллеровских клеток (ГКМ) в сетчатке глаза регистрировали спустя 48 ч после адаптирующей инъекции МНМ. Мюллеровские клетки сетчатки чутко реагируют на химическое воздействие. Ответ ГКМ (реактивный глиозиз) включает в себя увеличение размера ГКМ, пролиферацию и миграцию ГКМ к поврежденным участкам сетчатки и наиболее ранимому слою фоторецепторов. Эти 3 компонента ответа на МНМ наблюдались на микросрезах в виде FITC-фокусов (рис. 13). Фокусы представляют собой пролиферирующие клетки, включившие BUdR в ДНК. Подсчет таких фокусов на единичную площадь среза дает количественную меру ответа ГКМ на стресс. В ответ на дозу 70 мг/кг (однократно) наблюдалась достоверная активация ГКМ (см. рис. 13Б).

Фракционирование дозы МНМ (17+70 мг/кг) обнаружило снижение активации ГКМ (рис. 14) по сравнению эффектом от дозы 70 мг/кг. Хотя это снижение недостоверно (Р=0,08), мы обращаем внимание на уверенную тенденцию к снижению

Рис. 12. Схема (А) и результат (Б) эксперимента по влиянию фракционированного (17 +70 мг/кг) введения МНМ на ЭРГ у мышей

Рис. 13. Влияние МНМ на активацию клеток Мюллера в сетчатке глаза у мышей in vivo А - глиальные клетки Мюллера на срезах сетчатки, меченые анти-BrUdR антителами (показаны стрелками); Б - число фокусов на единицу площади среза ±SD через 48 ч после введения однократной дозы МНМ 70 мг/кг

Рис. 14. Средние значения количества активированных ГКМ на единичную площадь среза сетчатки (число фокусов/0,01 мм² среза) в ответ на однократное (МНМ70) и фракционированное (МНМ17+70) введение МНМ мышам

активации ГКМ в сетчатке после фракционирования МНМ, что говорит о снижении повреждающего действия двух доз МНМ по сравнению с одной 70 мг/кг.

Во второй серии экспериментов в качестве адаптирующего воздействия использовалось облучение протонами головы животных в дозе 1 Гр (радиационное прекондиционирование, гормезис). Как и в предыдущей серии, вторым (ударным) воздействием была внутрибрюшинная инъекция ретинотоксической дозы МНМ 70 мг/кг.

Эвтаназия и препаративные процедуры проводились спустя 48 ч после облучения. Результаты представлены на рис. 15. Как видно, инъекция МНМ в дозе 70 мг/кг приводит к массовой гибели фоторецепторов, о чем говорит локализация TUNEL-фокусов только в наружном ядерном слое сетчатки на микрофотографии (см. рис. 15А). Это же наблюдается и на вставках микрофотографий на рис. 15Б.

Попутно отметим, что морфологическая деструкция фоторецепторного слоя сетчатки менее выражена, хотя наблюдается разупорядочение фоточувствительных

Таблица 1

Схема эксперимента по адаптирующему эффекту облучения на сетчатку глаза мышей

Рис. 15. Радиацианное прекондиционирование (радиационный гормезис) сетчатки глаза через 48 ч после облучения

А - морфологические изменения и TUNEL-детекция погибших клеток в срезах сетчатки; Б - интенсивность флуоресценции ядерного слоя фоторецепторов сетчатки. Представлены точки средних значений для разных срезов

сегментов фоторецепторов, т.е. апоптотическая деградация ДНК и активация эндонуклеаз в ядрах фоторецепторов сетчатки в данном случае опережает по времени морфологические изменения сетчатки примерно на 24-48 ч.

Количественная оценка интенсивности TUNEL-флуоресценции (см. рис. 15Б), проведенная с помощью программы Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://rsb.info.nih.gov/rj/index.html), показала достоверное снижение цитотоксичности МНМ после протонного облучения в дозе 1 Гр по сравнению с эффектом только от МНМ (уровень значимости различий р