2,2. «Некультивируемые» клетки бактерий

Термин «некультивируемость» широко обсуждался в литературе (Barer and Harwood, 1999; Kell et aL, 1998), в частности, было предложено определение «жизнеспособные, но не х-ультивируемые» (viable but not culturable (VBNC)) (Roszak and Colwell, 1987), Однако термин «жизнеспособные, но некультивируемые» бактерии весьма противоречив, поскольку под жизнеспособностью клеток в микробиологии понимают именно культи виру ем ость (т.е.

14 должны скорее называться потенциально способными к размножению в каких-то конкретных

условиях (Kell et al.,1998; Barer, 1997), это мы и имеем в виду под термином некультивируемые

(НК). Подобную дефиницию можно дать многим микроорганизмам, поэтому следует определить

основные признаки присущие НК-клеткам.

Одним из основных критериев можно считать целостность клеточной мембраны: при серьезном повреждении клеточной стенки и мембраны клетку нельзя считать жизнеспособной, следовательно, она не может размножаться ни при каких условиях. Обычно НК клетки имеют уменьшенные размеры, коккоидную форму и утолщенную клеточную стенку (Oliver et al., 1991; Signoretto et ah, 2002; Signoretto et aL, 2000; Turpin et ah, 1993). Скорее всего, подобные изменения морфологии помогают клетке переживать стрессовые условия. /

Другим важным признаком характерным для НК клеток является изменение метаболизма и уменьшение дыхательной активности. Было показано, что НК клетки Micrococcus luteus имеют недетектируемый уровень дыхательной активности (Kaprelyants and Kell, 1993). В других случаях^х\ (Romalde et al., 1994; Magarinos et al., 3994). В то же время, в других случаях дыхательная активность часто считается признаком жизнеспособности клеток (Boucher et al., 1994; Garcia-Lara et al., 1993; Ramaiah et al., 2002). Также хорошим критерием, позволяющим оценить метаболическую активность клетки, является измерение мембранного потенциала (Kaprelyants and Kell, 1992).

Хотя НК формы микроорганизмов не могут быть культивируемы обычным образом, их нельзя относить просто к поврежденным клеткам, которые способны расти в обычных условиях, но при отсутствии таких селективных агентов как детергенты (Ray and Speck» 1973)* В целом, некультивирусмая форма бактерии должна отвечать следующим критериям: целостность клсткй, затухание метаболизма, способность к оживлению.

На сегодняшний день известно, что НК бактерии обнаруживаются практически везде, в природе (в почве, в воздухе, в водной среде), в лабораторных условиях, в живых организмах, в пище. Очень часто НК формы патогенных микроорганизмов, обнаруживаемые в естественных

15

условиях, способны стать возбудителями соответствующих заболеваний при проникновении в

хозяина (Chaiyanan et al., 2001; Rahman et al., 1996), что конечно не может не вызывать беспокойства.

Для изучения НК форм бактерий необходимо иметь возможность переводить культуры микроорганизмов в подобное состояние в лабораторных условиях, что является вовсе не тривиальной задачей, В большинстве случаев обычное голодание культуры не приводит к нужному результату. Подобные результаты были продемонстрированы со многими микроорганизмами, например, Vibrio anguillarum (Eguchi et al., 2000), Salmonella enteritidis (Chmielewsky and Frank, 1995), Aeromonas hydrophila (Wai et al., 2000; Mary et aL, 2002).

He существует универсальных способов перевода бактериальных культур в НК состояние, можно предположить, что подобная реакция на стресс имеет место в том случае, когда невозможен переход к более мягкой стратегии выживания при голодании. Это возможно, если условия стресса слишком тяжелы, в особенности, если они являются комбинацией нескольких неблагоприятных факторов.

Часто исследуется стационарная фаза культуры, которая вызвана голоданием по определенному параметру или веществу. В разработанной Уэйном модели дормантности для М. tuberculosis, при которой по его определению они «персестируют без деления» (Wayne and Sohaskey, 2001), подобное состояние культуры достигается из-за отсутствия кислорода (Wayne, 1976).

Судя по всему, через какое-то время наступает момент, когда персестируюшдя клетка должна либо погибнуть, либо продолжить рост. Скорее всего, в такой ситуации значительная часть популяции погибает, но за счет этого оставшиеся клетки приобретают возможность поделиться,

16

используя питательные вещества, освободившиеся при гибели других (криптический рост). Так, в случае с М. tuberculosis, клетки, 4 месяца находившиеся в запечатанных пробирках являлись НК в 100% случаев, но потом в течение нескольких месяцев количество КОЕ увеличивалось на 5-6 порядков (Shleeva et al., 2002).

Пекультивируемость - возможно одна из основных стратегий выживания многих микроорганизмов in vivo, В организме хозяина бактерия сталкивается со множеством стрессовых факторов, от низких значений рН и окислительного стресса, до различных агентов бактерицидного действия, которыми хозяин стремится защитить себя от инфекции. Существует множество примеров того, что микроорганизмы пребывают в латентном состоянии в организме хозяина. * Потенциально подобные бактерии могут представлять собой скрытый резервуар инфекции, способной к реактивации. До сих пор неясно, представляют ли собой латентные бактерии in vivo поврежденные клетки, или это обычные клетки, супрессировэнные иммунной системой хозяина.

Лучше всего в этом отношении изучена М. tuberculosis, HK формы которой обнаруживаются в легких в достаточных количествах, но при этом неизвестиоререходят ли эти формы к активному делению (Wayne, 1960). В корнелловской модели, где зараженные туберкулезом мыши получают лечение антибиотиками до полного отсутствия микобактерий в высевах из легких (стерильности), при этом, через 3 месяца примерно треть животных заболевает туберкулезом (McCune et al., 196ба,Ь). Этот пример, как и некоторые другие, показывает важное значение НК-форм патогенных микроорганизмов для медицины. Во-первых, становится понятно, что инфекционный агент может оставаться в организме пациента даже после интенсивной терапии (Velayati et al., 2002). Во-вторых, как в случае туберкулеза, это может привести к реактивации заболевания (Dubrov, 1976; Flynn and Chan, 2001; Lillebaek et ah, 2002), Можно предположить, что пекультивируемость - это стратегия выживания, _ используемая некоторыми патогенными микроорганизмами in vivo, позволяющая им становиться невидимыми для иммунной системы, сопротивляться действию многих антибиотиков, экономить энергию и тем самым существовать в организме хозяина длительное время.

17