2.3 Выход бактерий из НК состояния

Переход бактериальной клетки из НК состояния к нормальной жизнедеятельности, по всей видимости, является чрезвычайно сложным процессом, требующим постепенного восстановления всех обычных клеточных процессов, что в конечном итоге приводит к возможности дальнейшего роста (Kaprelyants and Kell, 1993).

При некультивируемом состоянии метаболизм клетки может быть поврежден (Poslgate, 1976) и некоторые компоненты среды, безвредные для нормальной клетки могут оказаться токсичными для клетки пробуждающейся. Так, для пробуждения дормантных клеток М. tuteus не подходит богатая среда (Mukamolova et al., 1998), это же справедливо для R. rhodohrous (Shleeva el al., 2002). В некоторых случаях пробуждение клеток возможно в жидкой среде и невозможно на твердой (Biketov et al., 2000; Boville and Mackey, 1997; Hu et al., 2000; Shleeva et al., 2002). Возможно, НК клетки не способны производить некоторые вещества необходимые для роста и их пробуждение происходит лучше при добавлении в среду таких компонентов как дрожжевой экстракт (Mukamolova et al., 1998; Shleeva et al., 2002). В случае с М, tuberculosis, добавление некоторых фосфолипидов, известны v как агенть^укрепляющие мембраны, в агар увеличивало ' число пробуждавшихся клеток (Zhang et al., 2001). Так же на пробуждение существенное влияние оказывает режим культивации (рН, температура, скорость качания колб).

Было установлено, что присутствие небольшого количества колониеобразующих клеток в голодающей популяции значительно облегчает "оживление" покоящихся клеток (Pignolo et al,. 1994). По-видимому, жизнеспособные клетки способны секретировать какие-то вещества, промотирующие переход покоящихся форм в активное делящееся состояние. Не исключено, что в этом и аналогичных случаях голодающие клетки обладают снихсенной способностью (или не могут вообще) синтезировать необходимые для деления ростовые факторы, что препятствует их нормальному размножению.

IS

разрушаться и выделять токсичные продукты. Постепенное накопление отравляющих веществ

вызывает остановку размножения бактерий и гибель всей популяции. Добавление же культуральной жидкости, выделенной из активной логарифмической культуры,- (и тем самым обеспечение необходимыми ростовыми факторами) приводит к нормальному росту клеток (Koch, 1993-94). В связи с этим немаловажным представляется уделить внимание социальному поведению бактерий и тому, как взаимодействие клеток в бактериальной популяции влияет на процессы w связанные с выходом из дормантного состояния.

2.4 Белки семейства Rpf— факторы роста и оживления «некулътивируемых» форм В нашей лаборатории было установлено, что растущие клетки М. luteus могут продуцировать фактор, стимулирующий восстановление покоящихся микрококков (Rpf). Это вещество способно промотировать "оживление" голодавших клеток. Rpf, термолабильный, не диализуемый и чувствительный к обработке трипсином, был очищен до гомогенности с использованием методов ионнообменной хроматографии (Mukamolova et al., 1998). Активным веществом, стимулировавшим восстановление покоящихся клеток, оказался белок с молекулярной массой порядка 19 кДа (согласно гель-фильтрации и электрофоретической подвижности). В пикомолярных концентрациях Rpf приводил к повышению количества культивируемых клеток на несколько порядков при "оживлении" голодавших микрококков.

Ген Rpf выделен и полностью расшифрован. Он кодирует белок, состоящий из 220

i аминокислот с характерной для грам-положительных бактерий сигнальной последовательностью

на N-конце (38 аминокислот). Предсказанный размер белка составляет 19148 Да.

Модифицированный специальной последовательностью из 10 гистидиновых , остатков (что

существенно облегчает очистку) Rpf (без сигнальной последовательности) был экспрессироваи в

£tt>tfHsml74(DE3).

Гены, гомологичные Rpf, обнаружены во многих микроорганизмах, объединяемых в группу

Г-Ц богатых бактерий.

бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium kprae (два гена).

19

Результаты гибридизации и ПЦР со специфическими праймсрами свидетельствуют о наличии

второго гена в геноме M.Iuteus, а также гомологичных генов в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacteriiim smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces а так же некоторых других (Рис. I, табл. 2). С другой стороны rpf-подобные гены не обнаружены во многих других микроорганизмах, гспоиы которых полностью расшифрованы в настоящее время (Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulvidus, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, IIelicobacter pylori, Methanococcus jannaschii, Methanococcus thermoauiotrophicum, Mycoplasma gemtalium, Mycoplasma pneumonias, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Syrwchocystis PCC6803).

Логично предположить, что продукты rpf-подобных генов в разных организмах могут выполнять аналогичные ему функции, и промотировать оживление покоящихся клеток.

20

SCE41-06C 244 а а

SCM11.29C 439 аа

ооагсж О

00

:оо

300 400 Я0 600

700

Rpf домен

LysM домен

Пептидаза М23/М37

1 "1 Линкер

Сигнальная последовательность

: Неизвестная функция

Micrococcus luteus 1

Corynebacterium glutamicum 2

Corynebacterium diphtherlae 4

Mycobacterium tuberculosis 5

Mycobacterium bovis 5

Mycobacterium leprae 3

Mycobacterium avium 4

Streptomyces coelicolor 5

Saccharopolyspora erythraea 4

Табл. 2. Аминокислотная последовательность рекомбинантного Rpf M luteus (заглавными буквами

выделен консервативный домен Rpf, жирным шрифтом выделены аминокислоты, консервативные ,

для многих микроорганизмов, подчеркиванием обозначен His-tag и его линкер из плазмиды рЕТ

ч - - !

19В), В таблице представлены некоторые микроорганизмы, у которых были обнаружены гены,

|/ имеющие гомологии с Rpf.

'" .■ . • ■

- " ■ -.-*•' Исследования, проведенные американскими учеными, показали, что при добавлении одного

из туберкулезных гомологов Rpf к неделящейся культуре М tuberculosis, сокращалась лаг-фаза и

на один-два порядка увеличиваюсь число КОЕ (Zhu et al„ 2003), В той же работе было

продемонстрировано, что отмытые клетки М. smegmatis быстрее начинали рост на бедной среде в

присутствии Rpf.

Сравнение структуры Rpf с другими белками выявляет присутствие в структуре белка

близко к С-концу так называемого Lys-M домена, служащего для прикрепления бактериальных

белков к клеточной стенке, в частностии белков участвующих в процессинге клетчной стенки. Эго

указывало на возможную принадлежность белков Rpf к ферментам, связанным с метаболизмом

22 клеточной стенки. Следующая глава посвящена ферментам клеточной стенки, задействованным в

процессах, связанных с активацией покоящихся форм бактерий.