Циклодекстриногенные бактерии — продуценты ЦГТаз

Большинство из выделенных продуцентов ЦГТаз обитают в почве и принадлежат к широкой группе бактерий порядка Bacillales, объединяющего несколько семейств (Paenibacillaceae, Bacillaceae, Thermoactynomicetaceae и др.), к которым, в свою очередь относятся уже 20 родов (данные на конец 2004 г.).

Paenibacillus macerans. Наиболее изучены циклодекстриногенные микроорганизмы, вида Paenibacillus macerans, впервые обнаруженные и описанные Шардингером в 1902-1905 гг. (до 1996 г. носили название Bacillus macerans). Принадлежат к семейству Paenibacillaceae поряд­ка Bacillales. Клетки культуры имеют форму палочек, строение клеточной стенки соответствует грамположительному типу, при выращивании на богатых средах, образуются длинные септиро- ванные нити. При недостатке питания формируют овальные споры, раздувающие спорангий. Положение спор в клетках может быть терминальным, (спорангии напоминают барабанные палоч­ки), субтерминальным и центральным. В условиях анаэробиоза для P.macerans характерна способ­ность к бродильному метаболизму, при этом на средах с глюкозой образуется большое количество газа. Не способны к росту на средах, содержащих более 5% хлорида натрия. После создания соот­ветствующих условий бактерии легко выделяются из почв с использованием накопительных куль­тур на основе альфа-циклодекстрина. Группа Р. macerans фенотипически компактна, и различные штаммы всегда секретируют внеклеточные альфа-ЦГТазы.

Циклодекстриногенная активность является характерной особенностью этого вида.

108

Часть II. Примеры применения биотехнологии БАВ в науке и производстве

в ней бактериальные клетки находятся как бы в фиксированном состоянии, размножаются микро­колониями, при выраженном недостатке субстрата. Развитие культуры в жидкой среде, в отсутст­вии физического контакта между клетками, при наличии избытка питательных веществ, зачастую приводит к нарушению процессов естественной споруляции. Проблема может быть решена метода­ми селекции штаммов, с улучшенной способностью к формированию спор на богатых средах. Куль­туры пассажируют в избытке субстрата, регулярно проводя жесткую термообработку инокулята ме­жду пересевами. Вегетативные клетки при температуре выше 70-80"С гибнут и выживают лишь спорулирующие варианты. Для Р. macerans типична секреция альфа-специфичной ЦГТазы. Куль­тивирование в ферментерах осуществляют в периодическом режиме, в аэробных условиях на бога­тых средах, содержащих крахмал в качестве индуктора фермента, источники аминного азота, а так­же мел, который предохраняет среду от избыточного закисления.

Bacillus circulans. Описано достаточно большое количество культур циклодекстриногенов, отнесенных к В. circulans, являющихся продуцентами внеклеточной бетаЦГТазы, секреция ко­торой может быть и не связана со спорообразованием (однозначных описаний нет). Известные штаммы В. circulans выращивают в аэробных условиях на жидких питательных средах, содержа­щих крахмал или муку, а также ростовые добавки.

Алкалофильные бациллы — продуценты ЦГТазы известны с начала 1970-х гг. прошлого столе­тия. Впервые были выделены японским микробиологом К. Хорикоши, их открытие послужило отправной точкой для организации масштабных технологических процессов бета-циклодекстрина по типу неконтролируемой конверсии. В большинстве случаев алкалофильные бациллы являются носителями генов бета-ЦГТазы. Обсуждаемые разновидности бацилл циклодекстриногенов таксо­номически весьма гетерогенны и об этом свидетельствует спектр названий, использованных для обозначения штаммов-продуцентов. Описаны и частично охарактеризованы алкалофильные и алкалотолерантные культуры, обозначенные B.circulans var. alkalophilus (р-ЦГТаза, Nakamura, Horikoshi, 1976); В. firmus alkalophilus, (р-ЦГТаза, Do с соавт., 1993); В. firmus/lentus 290-3 (у-ЦГТаза Schmid с соавт., 1988); B.lentus (р-ЦГТаза, Sabione, Park, 1992); B. agaradhaerens LS-3C (Martins c cobt. 2003).

Культивирование алкалофильных и алкалотолерантных бацилл осуществляют в ферментерах, в условиях активной аэрации, при этом используются щелочные питательные среды разнообразно­го состава (pH = 9 — 10), содержащие в своем составе до 1% карбоната натрия.

Продуценты циклодекстринглюканотрансферазы, развивающиеся при нормальных значе­ниях pH. Среди нормофильных (развивающихся при нормальных pH) бацилл с циклодекстрино­генной активностью, могут быть упомянуты лишь единичные культуры, идентифицированные авторами в качестве В. subtilis 313 (у-ЦГТазаКаго, Horikoshi), 1986; В. coagulans YH-1306 (р-ЦГТа- за Horikoshi 1989); В.

Термотолерантные циклодекстриногены. В попытках выделить продуценты ЦГТаз, обладаю­щих высокой термостабильностью, были изучены культуры, обозначенные авторами в качестве В. stearothermophilus ИНМИА-3849, (а+р-ЦГТаза Абелян В.А., 1991); В. stearothermophilus SE-4 (р-ЦГТаза Edahiro, Yamamoto, 1992); В. stearothermophilus ТС-91 (р-ЦГТаза Sakai et al., 1987); В. stearothermophilus (а+р-ЦГТаза Fujiwara et al., 1990). Культуры развивались при температурах 60 °С на средах относительно небогатого состава, в аэробных условиях и, по данным авторов, секре­тировали ЦГТазы с термостабильностью Т_опт = 65-80 °С. Это были как бета-ЦГТазы, так и фермен­ты со смешанной специфичностю (альфа+бета-ЦГТазы), катализировавшие синтез примерно рав­ных пропорций альфа и бета-циклодекстринов. В 2001 г. представители В. stearothermophilus были отнесены к роду Geobacillus.

К порядку Bacillales (семейство Thermoactinomycetaceae) относятся, по всей видимости, штаммы, выделенные в 1995 г. В.А.Абелян и обозначенные Thermoactinomyces sp. (штаммы ИНМИА-А561

и А554). ЦГТазы перечисленных культур проявляли высокую стабильность в интервале pH 5,5-8,5, а максимальную циклизующую и декстриногенную активность при pH 6,0-7,0 при температурах ниже 55—60 °С. Другой штамм Thermoactinomyces thermosulfurigen.es EMI был выде­лен Wind с соавторами также в 1995 г.

Продуценты ЦГТаз, не относящиеся к порядку ВасШасеае. Прежде всего, в обозначенную груп­пу следует отнести два штамма Klebsiella (порядок Enterobacteriales семейство Enterobacteriaceae).

Среди малоизученных штаммов, с циклодекстриногенной активностью следует назвать отдель­ные изоляты Micrococcus varians и Micrococcus luteus, выделенные Yagi в 1982 г. Клетки культур были представлены неподвижными сферическими клетками, не образовывашими спор и анаэроб­но развивавшихся при pH = 6,8 - 8,5 при t = 25 - 37 °С.

Существенный практический и теоретический интерес представляют сообщения об обнаруже­нии единичных циклодекстриногенных культур среди бревибактерий Brevibacterium sp. 9605 (Mori с соавт, 1994), облигатных анаэробов Clostridium thermohydroamylolyticum АТСС 39252, АТСС 53016, (Starnes, 1991). архей-гипертермофилов Thermococcus sp. В001 (Tachibana с со­авт. 1999), псевдомонад Pseudomonas species NRRL B-18375 (Allenza, 1990).

9.