Сложные методы окраски бактерий

Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод окраски бактерий, позволяющий отнести клетки по типу окраски стенки к грациликутам (грамотрицательным) или фирмикутам (грамположительным).

Практика показывает, что более чистые препараты без ущерба для дифференциации получаются, если после окраски генцианвиолетом мазок слегка споласкивают водой, остатки которой стряхивают и только потом наносят раствор Люголя.

Модификация по А.П. Синеву. На фиксированный мазок кладут полоску бумаги с красителем, наливают 2-3 капли воды и окрашивают 2 минуты. Далее поступают как описано выше.

Модификация по Керри. Мазок окрашивают 1-2 минуты спиртовым раствором генцианвиолета, обрабатывают 1-2 минуты раствором йода, затем 30-40 секунд этанолом. Промывают. Повторно обрабатывают 1 минуту раствором йода, промывают, докрашивают 1-2 минуты фуксином или смесью сафранина с бриллиантовой зеленью.

Модификация Берка. Раствор А: 1%-ный раствор кристаллвиолета в дистиллированной воде.

Протрава: йод кристаллический – 1 г, йодистый калий — 2 г, дистиллированная вода – 100 мл.

Растворитель для обесцвечивания: этиловый эфир – 1 объем, ацетон – 3 объема.

Дополнительный краситель: 2%-ный раствор сафранина в дистиллированной воде.

Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в раствор А, Мазок ополаскивают в йодной протраве и покрывают его свежей протравой на 2 мин.

Модификация Хукера

Раствор А: кристаллвиолет – 2 г, 95%-ный этанол — 20 мл.

Раствор Б: щавелевокислый аммоний – 0,8 г, дистиллированная вода — 80 мл.

Раствор А и Б в приготовленных объемах смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч.

Раствор В: 2,5%-ный раствор сафранина (в 96%-ном этаноле) – 10 мл, дистиллированная вода — 100 мл.

Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь растворов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают; наносят 96%-ный этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают, помещают в раствор В на 10 секунд, слегка промывают водой, подсушивают, микроскопируют.

Тест с гидроксидом калия для контроля результатов окраски бактерий по Граму. Если окраска по Граму нечеткая, этот метод позволяет уточнить полученный результат.

Постановка теста. На предметное стекло наносят 1-2 капли 3%-ного раствора КОН. Агаровую культуру бактериологической петлей вносят в КОН, перемешивают и затем поднимают петлю вверх. Если культура в виде «нити» тянется за петлей — грамотрицательная, при отсутствии этого феномена — грамположительная бактерия.

Методы окраски кислотоустойчивых бактерий

Окраска по Циль-Нильсену. Готовят карболфуксиновый краситель: основной фуксин – 0,3 г, 95%-ный этанол — 10 мл, фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) — 5 мл, дистиллированная вода – 95 мл.

Основной фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол, перемешивают, выдерживают 5-7 дней при комнатной температуре; перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

Растворитель для обесцвечивания (солянокислый спирт): этанол 95%-ный — 97 мл, соляная кислота концентрированная — 3 мл.

Методика. На фиксированный нагреванием мазок наливают карбол-фуксиновый краситель, подогревают до отхождения паров (но не кипятить!). Через 5 минут промывают водой. Затем мазок обрабатывают 30-50 сек растворителем для обесцвечивания, промывают водой, после чего пленка бактерий на мазке становится бледно-розовой.

Мазок докрашивают 3-5 минут дополнительным красителем (метиленовый синий и т.д.), промывают водой, высушивают.

Кислотоустойчивые микроорганизмы в мазке красного цвета, другие — синего.

Окраска аурамином. Раствор А: аурамин — 1,5 г, родамин В — 0,75 г, глицерин — 75 мл, фенол расплавленный — 10 мл, вода дистиллированная — 50 мл.

Красители: фенол и глицерин растворяют в 25-30 мл воды, добавляют оставшийся объем воды и фильтруют через стекловату.

Раствор Б: 70%-ный этанол — 99,5 мл, кислота соляная концентрированная — 0,5 мл.

Раствор В: калий марганцевокислый — 0,5 г, вода дистиллированная — 99,5 мл.

Методика. Фиксированный над пламенем горелки мазок 15 мин окрашивают раствором А при комнатной температуре или при 37-38° С. Промывают под струей воды до обесцвечивания. Наливают на мазок на 3-5 мин раствор Б, промывают и докрашивают еще 2-4 мин раствором В. Промывают, высушивают, микроскопируют в люминесцентном микроскопе под иммерсией (возбуждающий светофильтр ВG-12, запирающий ОG-1).

Кислотоустойчивые бактерии желто-оранжевого цвета на темном фоне.

Окраска по Муху. Препарат выдерживает 24 часа в растворе метилвиолета (10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета, 100 мл 2%-ного водного раствора карболовой кислоты). На 1-2 минуты наносят раствор Люголя, далее на 1 мин 5%-ный раствор азотной кислоты и 10 секунд 3%-ный раствор соляной кислоты. Затем на препарат до прекращения отхождения краски наносят смесь этанола и ацетона (1:1), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Методы окраски спор

Метод Ауески. Высушенный на воздухе мазок без фиксации обрабатывают 2-3 мин (при подогревании) 0,5%-ной серной кислотой, промывают и фиксируют над пламенем.

Метод Меллера. Фиксированный над пламенем мазок протравливают 2-3 мин 5%-ной хромовой кислотой, промывают, окрашивают карболовым фуксином Циля. Обесцвечивают и окрашивают также, как и по методу Ауески.

Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиленовой синью с подогревом до закипания. Краску смывают и докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 секунд. Промывают, высушивают. Споры синие, вегетативные клетки — красные.

Метод Шеффера-Фултона. На фиксированный нагреванием мазок, покрытый фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени. Мазок помещают на 5 мин над кипящей водой. Промывают и докрашивают 30 сек 2%-ным водным раствором сафранина. Промывают, высушивают. Споры ярко-зеленого цвета, вегетативные клетки — красно-коричневого.

Метод Трухильо. Мазок фиксируют над пламенем горелки, покрывают насыщенным водным раствором малахитовой зелени, подогревают до появления пара и окрашивают 3 минуты. Краску смывают водой и докрашивают мазок 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 1 мин. Промывают, высушивают. Споры зеленого цвета, вегетативные клетки — красного.

Метод Дорнера. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 5-10 мин карболовым фуксином при подогревании, 1 мин обесцвечивают солянокислым спиртом (3 мл концентрированной соляной кислоты и 97 мл 96%-ного этанола). Препарат промывают, высушивают фильтровальной бумагой и наливают на мазок тонким слоем 10%-ный раствор нигрозина в 0,5%-ном растворе формалина. Не промывая, мазок высушивают на воздухе и микроскопируют. Споры — красные, вегетативные клетки — бесцветные на черном фоне.

Метод Валъдмана. На фиксированный препарат наносят синьку Леф-лера (щелочную) и нагревают до кипения, затем охлаждают и промывают водой.

Метод Ожешки. На нефиксированный мазок наливают 0,5%-ный раствор НС1 и подогревают 1-2 минуты. Сливают кислоту, промывают препарат водой, подсушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циль-Нильсена. Микроскопическая картина: споры – красного, вегитативные клетки – синего цвета.

Методы окраски капсул

Способ Романовского-Гимза. Фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова мазок помещают в краску Романовского-Гимза (15-20 капель краски на 10 мл дистиллированной воды) на 15-20 мин. Промывают, высушивают. Тело бактерий окрашивается в темно-синий цвет, капсулы — в розовый.

Способ Ольта. Фиксированные мазки над пламенем горелки окрашивают 1-3 мин 2%-ным водным раствором сафранина (сафранин растворяют в горячей воде, фильтруют, применяют свежеприготовленный раствор). Тело бактерий окрашивается в коричневый цвет, капсула — в бледно-желтый.

Способ Ребигера. Нефиксированный мазок окрашивают в течение 15-20 сек раствором генцианвиолета в формалине (15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают, фильтруют), промывают водой. Тело бактерий — темно-фиолетового цвета, капсула — красновато-фиолетового.

Способ Антоны. Мазок окрашивают 2 мин 1%-ным водным раствором кристаллвиолета. Краску смывают 20%-ным водным раствором сульфата меди (СuSO₄·5Н₂О), избыток раствора стряхивают и мазок, не промывая водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микробы — темно-фиолетовые, капсула — светло-голубая.

Способ Гинса. На предметное стекло наносят каплю черной туши, раз-веденной 1:3 дистиллированной водой и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. В капле туши суспензируют петлей культуру и делают мазок (подобно мазку крови). Высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным 1:3. Тела бактерий — красные. Капсула на темном фоне видна в виде светлого ореола вокруг бактерий.

Способ Михина. Мазок окрашивают в течение 3-5 мин синькой Леф-флера (пригодна только краска, хранившаяся не менее 20-30 дней, т.к. при хранении в ней образуется азур, придающий метахроматичность). Тела бактерий — синие, капсула — розовая.

Способ Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади (или каплю обезжиренного молока), петлей вносят в нее культуру, суспензируют и готовят мазок. Высушивают пленку бактериальной суспензии на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают при подогревании в течение 1 мин 0,1%-ным водным кристаллвиолета. Мазок промывают 20%-ным водным раствором сульфата меди, высушивают фильтровальной бумагой. Капсулы в мазке — бледно-голубого, тела бактерий — темно-фиолетового цвета.

Способ Дюгида. На предметное стекло помещают каплю черной туши, суспензируют в ней культуру. Каплю покрывают покровным стеклом, фильтровальной бумагой удаляют излишки туши. На коричнево-черном фоне видны преломляющие свет бактерии, окруженные капсулой в виде прозрачной зоны.

Способ Ионе. На один конец поверхности предметного стекла наносят каплю туши, разведенной 1:2-1:4 дистиллированной водой. В капле суспензируют бактерии и готовят мазок (как мазок из крови). Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают 2 мин 2%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором фуксина. Промывают водой, обрабатывают 8-10 секунд 2%-ным раствором уксусной кислоты и вновь промывают. В мазке вокруг интенсивно окрашенных бактерий видна неокрашенная капсула.

Метод окраски жгутиков

О наличии жгутиков у бактерий судят по косвенным признакам, например по подвижности клеток в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля», а также по характеру роста испытуемой культуры в полужидком агаре (0,15-0,3%). В последнем случае испытуемую культуру засевают уколом в ПЖА и инкубируют в течение 18-24 часов. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии укола, вызывая помутнение среды, неподвижные растут только по уколу. В отдельных случаях применят методы окраски, позволяющие наблюдать непосредственно жгутикию

При всех методах окраски следует готовить препараты из молодых агаровых культур (14-20-часового роста). В пробирки с культурой на скошенном агаре на 30-40 мин добавляют 0,5%-ный водный раствор пептона. Жидкость отстаивают, для осаждения перешедших в нее микробов, центрифугируют. Осадок заливают физиологическим раствором и центрифугируют повторно. С целью предотвращения потери жгутиков отмытый осадок ресуспензируют в 10%-ном растворе формалина для получения слегка мутной суспензии.

Окраска жгутиков осмиевой кислотой. На чистом обезжиренном предметном или часовом стекле смешивают каплю суспензии бактерий с каплей 2%-ного раствора осмиевой кислоты. Полученную каплю смеси тонким капилляром пастеровской пипетки наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Высушивают на воздухе и фиксируют на пламени (избегать перегревания!).

На фиксированный препарат наливают протраву, приготовленную за несколько суток (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 20%-ного водного раствора танина и 5,5 мл насыщенного водного раствора сернокислого аммиака железа). Через 15 мин протраву смывают водой, докрашивают 4 мин фуксином, промывают и микроскопируют.

Окраска жгутиков серебрением. Из суспензии готовят тонкий мазок, высушивают и фиксируют в течение 2-3 минут 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Промывают препарат, погружением на 2-3 с в 0,5%-ный водный раствор азотнокислого серебра и, не промывая, опускают на 2-3 с в протраву (пирогаллол или галловая кислота — 2,0 г, танин – 1,2 г, натрий уксуснокислый – 4,0 г, вода дистиллированная — 150 мл). Вынимают из протравы и снова погружают в раствор азотнокислого серебра, выдерживая до тех пор, пока препарат не почернеет. После промывки проводят микроскопию.

Окраска жгутиков по Плиммеру. Готовят краску: танин — 5,0 г, цинк хлористый — 5,0 г, алюминий хлористый — 10,0 г, фуксин в порошке – 0,75 г навески перечисленных компонентов растирают в ступке, постепенно порциями добавляя 40 мл 60%-ного этанола до их полного растворения. Перед употреблением краску разводят водой (1:5).

На высушенный тонкий мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и заливают приготовленной краской. Через 2 мин краску смывают водой и дополнительно окрашивают карболовым фуксином Циля. Бактерии и жгутики — красного цвета.

Окраска жгутиков по Беничетти. Заранее готовят 3 раствора. Раствор 1: цинк сернокислый — 0,5 г, танин — 8,0 г, вода дистиллированная — 50 мл. Раствор 2: насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов. Раствор 3: насыщенный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета. Перед употреблением растворы смешивают (5:5:3). На высушенный мазок наливают смесь растворов и нагревают до появления пара. Через 3 мин промывают и микроскопируют. Жгутики фиолетово-черного цвета.

Окраска по Валенти. Мазок обрабатывают 3 мин 20%-ным раствором танина при подогревании, промывают, окрашивают 10 мин карболовым фуксином при подогревании. Промывают, микроскопируют. Бактерии и жгутики — красного цвета.

Окраска по Грэю. Раствор А: дубильная 20%-ная водная кислота — 2 мл, насыщенный водный раствор калийных квасцов — 5 мл, хлористая ртуть, насыщенный водный раствор — 2 мл, основной фуксин 3%-ный в 96%-ном этаноле — 0,4 мл. Краситель (фуксин) добавляют к остальным ингредиентам непосредственно перед употреблением и после его растворения полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу. Раствор Б: карболовый фуксин Циля (основной фуксин 3%-ный на 95%-ном этаноле — 10 мл, фенол — 5 мл, дистиллированная вода — 95 мл).

Методика. Каплю бактерий (суспензию) в формалине наносят на стекло и дают ей стечь. Высушивают на воздухе. Кладут полоску фильтровальной бумаги и на 4-6 мин наливают раствор А. Промывают водой и 3 мин окрашивают через фильтровальную бумагу раствором Б. Промывают, высушивают, микроскопируют. Жгутики и бактерии — красного цвета.

Окраска по Ляйфсону. Готовят 3 раствора. Раствор 1: 1,5%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде. Раствор 2: 3%-ный раствор дубильной кислоты в дистиллированной воде. Раствор 3: уксуснокислый розанилин — 0,9 г, солянокислый прозанилин – 0,3 г, 96%-ный этанол — 100 мл. Смешивают поровну растворы 1 и 2 и затем 2 объема этой смеси приливают к 1 объему раствора 3. Смесь сохраняется в холодильнике до 3 месяцев.

Методика. Каплю суспензии наносят на хорошо обезжиренное стекло и дают ей стечь. Высушив, очерчивают карандашом по стеклу границы пленки бактерий, на 7-15 мин площадку заливают красителем. Выдерживают до тех пор, пока поверхность красителя приобретет золотистый цвет, а пленка бактерии не будет покрыта осадком. Промывают, высушивают. Бактерии и жгутики – красного цвета.

Методы окраски клеточной стенки

Окраска клеточной стенки имеет диагностическую ценность при дифференциации микоплазм от бактерий.

Метод Гутштейна. Препарат фиксируют 1-2 часа в жидкости Буэна, выдерживают 2-3 минуты в 5-10%-ном водном растворе танина, ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового.

Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: этанол 90%-ный – 60 мл, хлороформ — 30 мл, уксусная эссенция – 10 мл. Далее препарат выдерживают в течение 2-5 минут в 10%-ном водном растворе танина, промывают водой, красят 30-60 секунд фуксином Пфейффера и, не перемешивая, подсушивают и микроскопируют.

Метод) Робиноу. Исследуемый микроорганизм выращивают на агаровой среде в чашке Петри, вырезают агаровый блок и кладут его поверхностью на покровное стекло, помещают на ночь в жидкость Буэна. На следующий день удаляют агар, стекло отпечатком вниз кладут на поверхность 5-10%-ното водного раствора таниновой кислоты на 20-30 минут. Затем препарат промывают водой, покровное стекло клетками бактерий вниз кладут на поверхность 0,02%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 5-10 секунд. В итоге клеточные оболочки и перегородки окрашиваются в темно-синий или в черный цвет, а цитоплазма остается неокрашенной.

Методы окраски цитоплазматических включений

При идентификации микроорганизмов определенное значение имеют данные о наличии в клетках включений, отражающих тип и направленность конструктивного метаболизма. К цитоплазматическим включениям относят поли-бетта-оксимасляную кислоту, зерна метахроматина (волютина) и полисахариды.

Поли-бетта-оксимасляная кислота представляет собой полиэфир бетта-оксимасляной кислоты, который накапливается в цитоплазме клеток в виде округлых или овальных гранул размером 200-800 нм. Метахроматин — это полифосфаты, а полисахариды – глюканы, состоящие из D-глюкозы, размером до 200 нм. Перечисденные включения выполняют роль своеобразных запасов веществ клеток и могут быть обнаружены специальными методами окраски.

Обнаружение поли-бетта-оксимасляной кислоты

Фиксированный над пламенем горелки мазок окрашивают 5-15 мин 0,3%-ным раствором Судана черного В в этиленгликоле. Краску сливают и после высушивания на воздухе без промывания водой ополаскивают в ксилоле. Дав мазку высохнуть, опускают на 5-10 с в 0,5%-ный водный раствор сафранина. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Включения поли-бетта-оксимасляной кислоты видны на розовом фоне цитоплазмы в виде черно-синих образований.

Обнаружение метахроматина (волютина)

Метод Нейссера. Готовят 4 раствора. Раствор А: метиленовый синий — 0,1 г, этанол 95%-ный — 2 мл, уксусная кислота ледяная — 6 мл, вода дистиллированная— 100 мл. Раствор Б: кристаллвиолет— 1 г, этанол 95%-ный — 100 мл, вода дистиллированная — 300 мл. Раствор В йод кристаллический — 1 г, калий йодистый — 2,0 г, вода дистиллированная — 300 мл. Раствор Г: хризоидин — 1 г, вода дистиллированная— 300 мл (хризоидин растворяют в горячей воде). На фиксированный над пламенем горелки мазок на 1 мин наливают смесь раствора А и Б в соотношении 2:1 (смесь готовят перед окраской). Сливают краску, обрабатывают 1 мин раствором В (раствор Люголя) и промывают водой, высушивают, микроскопируют. Клетки бактерий светло-желтого, зерна волютина — темно-синего цвета.

Метод Раскиной. Готовят краску следующего состава: карболовый фуксин Циля — 4 мл, насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини — 4 мл, кислота уксусная ледяная — 5 мл, этанол 96%-ный — 95 мл, вода дистиллированная —92 мл. На фиксированный над пламенем горелки мазок наливают краситель, нагревают над горелкой до сгорания спирта, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Клетки бактерий окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина — в черно-синий.

Обнаружение полисахаридов

Окраска реактивом Шиффа. Готовят 4 раствора. Раствор А (раствор периодата): 4%-ный раствор йодной кислоты — 20 мл, 0,2 М водный раствор ацетата натрия — 10 мл, 96%-ный этанол — 70 мл. Раствор чувствителен к свету, поэтому его следует хранить в темной склянке в темноте.

Раствор Б: калий йодистый — 10 г, пятиводный тиосульфат натрия — 5 г,2н. Раствор соляной кислоты — 5 мл, 96%-ный этанол — 300 мл, вода дистиллированная – 200 мл. Йодистый калий и тиосульфат натрия растворяют в дистиллированной воде, добавляют этанол и затем раствор соляной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре до выпадения осадка серы. Используют прозрачную надосадочную жидкость.

Раствор В (реактив Шиффа). В 400 мл дистиллированной воды растворяют 2 г фуксина основного, охлаждают до 50-60°С и фильтруют через бумагу. К фильтрованной краске добавляют 10 мл 2N раствора соляной кислоты и 4 г калия метабисульфата. Смесь выдерживают 12-18 часов в холодильнике, в герметически закрытом сосуде. Перед использованием к смеси добавляют еще 10 мл 0,2 н раствора соляной кислоты. При высыхании на стекле реактив не должен оставлять розового налета.

Раствор Г: калия метабисульфат – 2 г, концентрированная соляная кислота – 5 мл, вода дистиллированная – 500 мл.

На фиксированный нагреванием мазок наливают на 5 мин раствор А, промывают 70%-ным этанолом, обрабатывают раствором Б и промывают водой. Окрашивают 51-5 мин раствором В (экспозицию устанавливают опытным путем). Несколько раз ополаскивают мазок раствором Г и после промывания водой окрашивают 2-5 секунд 0,002%-ным водным раствором малахитовой зелени. Промывают водой, высушивают, микроскопируют. Цитоплазма клеток окрашивается в зеленый цвет, полисахаридные включения – в красный.

Окраска алциановым синим. Мазок, фиксированный нагреванием, окрашивают 1 мин алциановым синим (1%-ный спиртовой раствор краски, разведенной перед применением водой 1:8), промывают водой, высушивают. На мазок наливают карболовый фуксин Циля и сразу же промывают водой. Цитоплазма клеток красного цвета, полисахаридные включения – голубого.

Методы прямого флуорохромирования бактерий

Для выявления некоторых видов бактерий и отдельных структур прокариот используют обработку препаратов флуорохромами с последующим изучением в люминисцентном микроскопе. Наиболее широко этот метод применяют для выявления возбудителя туберкулеза. При этом применяют следующие реактивы:

Раствор аурамина ОО. 0,1 г аурамина ОО растворяют в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора фенола.

Раствор «тушителя». 1 г кислого фуксина растворяют в 390 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл концентрированной уксусной кислоты.

Солянокислый спирт. К 90 мл 96%-ного этилового спирта добавляют 4 мл соляной кислоты, 4 г хлорида натрия и доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Фиксатор Никифорова. К одному объему 96%-ного этилового спирта добавляют равный объем серного эфира. Мазки из исследуемого материала готовят как и для микроскопии, затем окрашивают аурамином 15 минут, промывают водой, обрабатывают в течение 5 минут солянокислым спиртом, промывают водой. Вначале препарат промывают водой, обрабатывают 2 минуты «тушителем», промывают водой. Вначале препарат просматривают с объективом х40, а затем с иммерсионным (х90). При среднем объективе туберкулезные бактерии видны в виде золотистых черточек, под объективом х90 на темном фоне обнаруживают светящиеся золотисто-зеленые палочки возбудителя.

Методом прямого флуорохромирования хламидий изложен в действующих технических нормативных правовых актах.