Лигирование

13. На основании оценки концентраций ДНК вектора и вставки (п. 12), рассчитайте необходимый объем каждого из компонентов реакции лигирования.

Внимание! Рекомендуемое соотношение ДНК вектора и вставки для реакции лигирования рассматривались в разделе 2.5.3.

14. Приготовьте смесь для лигирования (10 мкл):

1 мкл 10х буфер для лигазы;

20 нг линеаризованный вектор (раствор в буфере для

элюции);

20 нг ДНК вставки (раствор в буфере для элюции);

1 мкл T4 ДНК лигаза;

1 0 мкл суммарный объем.

15. Инкубируйте смесь при 14-16°С в течение ночи.

16. Осуществите обработку лигазной смеси эндонуклеазой

рестрикции SmaI, (процедура обязательна, если ДНК вектора не очищали на агарозном геле, см. п. 11). Для этого добавьте 0,5 мкл эндонуклеазы рестрикции SmaI непосредственно в реакцию

лигирования и инкубируйте 0,5-1,0 ч при комнатной температуре.

Внимание! Эндонуклеаза рестрикции SmaI имеет температураный оптимум при 25^оС и активна в буфере для лигирования. Сайт ее узнавания есть в полилинкере вектора, и отсутствует в последовательности ДНК флуоресцентного белка Clavularia.

После реакций лигирования и обработки SmaI очистка ДНК не требуется.