Клонирование

Для клонирования по сайтам рестрикции вектор и амплифицированный фрагмент ДНК должны быть предварительно подготовлены. Подготовка вставки включает очистку амплифицированной ДНК, обработку ее эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII по сайтам, введенным в структуру праймеров, и финальную очистку перед лигированием.

Вектор обрабатывают теми же рестриктазами, сайты узнавания которых расположены в полилинкере. После этого вектор необходимо почистить от остатков недорезанного вектора (для снижения количества нерекомбинантных колоний при трансформации).

Очистку вектора проводят путем разделения реакционной смеси после рестрикции в препаративном агарозном геле (0,8-1,0%) и вырезания целевой полосы (линеаризованный вектор) под длинноволновым (мягким) ультрафиолетом. Затем проводят экстракцию ДНК из геля на колонке, и получают линейную форму плазмиды с выступающими «липкими» концами.

Стадию вырезания из геля иногда опускают вследствие ее трудоемкости и отсутствия источника мягкого ультрафиолета, ограничиваясь очисткой на колонке после рестрикции.

В общем случае это ведет к снижению эффективности клонирования и усложнению нахождения целевых рекомбинантных клонов. Однако, в случае работы с генами флуоресцентных белков, рекомбинантные колонии можно легко отобрать по их флуоресценции в ультрафиолете.

Внимание! Иногда практикуют метод «дорезания» реакции лигирования, когда в реакционную смесь после окончании лигирования добавляют любую рестриктазу, сайт узнавания которой расположен в полилинкере между использованными для клонирования сайтами и отсутствует в целевом фрагменте. Этот прием можно использовать только в тех случаях, когда клонируют вставку с известной последовательностью. В выполняемой задаче с геном флуоресцентного белка такой рестриктазой может быть SmaI.

Подготовленные вектор и вставка лигируют с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4 (далее - лигаза). Комплементарные «липкие» концы молекул «сшиваются» лигазой с образованием кольцевых молекул. Для эффективного прохождения реакции нужно соблюсти оптимальную пропорцию вектора к вставке. При клонировании по «липким» концам оптимальное соотношение вектор:вставка - 1:3 - 1:5 (по молям!).

Внимание! Вектор pQE-30 имеет длину 3600 п.н., вставка - 800 п.н. Таким образом, размер плазмиды примерно в 4-5 раз больше размера вставки. Поэтому массовая доля вставки и вектора в реакции должна быть одинакова, при этом будет достигнуто соотношение 1:5 по «липким» концам.

2.5.4.