ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В задачи настоящей работы входило систематическое изучение по единому плану возможных токсических эффектов, вызываемых пероральным введением фуллерена Сб0 и фуллеренола Сб0(ОН)24 лабораторным животным (крысам), в подостром эксперименте длительностью 28-92 суток с осуществлением контроля набора показателей, характеризующих состояние организма животного в соответствии с действующими в Российской Федерации методическими указаниями по оценке безопасности наночастиц и наноматериалов, утверждёнными в установленном порядке (МУ 1.2.2520-09).

Первая проблема, которую следовало разрешить при проведении исследований, относилась к выбору формы введения и доз фуллерена Сб0 и фуллеренола Сб0(ОН)24. Как показал анализ данных литературы, различные методические подходы, основанные на получении дисперсий фуллерена с использованием систем вода-органические растворители, являются непригодными для целей настоящего исследования, поскольку не позволяют гарантировать отсутствие грубого токсического воздействия носителя, содержащего практически неудаляемые примеси органического растворителя, на организм животных. Альтернативные подходы, стоящие в получении чисто водных «растворов» фуллерена с помощью длительного перемешивания, растирания, ульразвуковой обработки были также признаны непригодными, поскольку не позволяли получить на практике дисперсии фуллерена достаточно высокой концентрации и в достаточно больших количествах, а также не исключали возможности неконтролируемых окисления и химической модификации обрабатываемого фуллерена. В результате был сделан выбор в пользу сравнительно простой, воспроизводимой и высокопроизводительной методики получения стабильных дисперсий фуллерена в растворе биополимера - кукурузного крахмала, являющегося нутриентом (частично расщепляемый под действием амилаз слюны и панкреатического секрета, и частично ферментируемый кишечной микрофлорой сложный углевод), а также

малотоксичным, разрешенным к применению в составе пищевых продуктов в качестве пищевой добавки, поверхностно-активным веществом Твин 80.

Доза фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 в проведенных исследованиях, составляла до 10 мг/кг массы тела лабораторного животного, что в пересчёте на массу тела человека соответствует приёму 0,7-0,9 г этих веществ в день и является значительной аггравацией в условиях реально возможных сценариев экспонирования человека этими веществами в составе пищевых продуктов или косметических средств (при их случайном приёме внутрь).

Анализ размеров частиц фуллерена С60, получаемых путём его диспергирования в системе крахмал - Твин 80 был проведен методом спектроакусического исследования и показал, что основная часть частиц дисперсной фазы фуллерена представлена частицами в нанометровом диапазоне размеров средним диаметром около 31 нм. Следует отметить, что каждая такая частица состоит из значительного числа молекул фуллерена, средний диаметр которых составляет около 0,7 нм. Приблизительный подсчёт показывает, что число молекул фуллерена С60 в объёме одной частицы при условии их плотной сферической упаковки может составлять прядка (5-8)?10⁴штук. Тем не менее, для наночастиц такого размера имеется значительный объём данных литературы, свидетельствующий о возможности и трансэпителиального транспорта (проникновения) через слизистую оболочку тонкой кишки, по механизмам эндоцитоза и персорбции [167, 79, 32, 136]. На основе анализа данных литературы, полученных с использованием преимущественно радиоизотопных меток можно было предположить, что биодоступность нанодисперсной (мицеллярной) формы фуллерена С60 является сравнительно низкой (по- видимому, около 3% от однократно введённой дозы), что, тем не менее, является физиологически значимым, особенно с учётом липофильности этого соединения и возможности его кумуляции в различных органах и тканях (в первую очередь, в печени).

Что же касается фуллеренола С60(ОН)24, то это соединение было хорошо растворимо в воде, что не создавало проблем при его пероральном введении. Тем

не менее, анализ его растворов методом динамического лазерного светорассеяния показал, что фуллеренол представлен в водной фазе не только свободными молекулами, но и мультимолекулярными ассоциатами (кластерами) в нанометровом диапазоне размеров, состоящими, оценочно, из 10-50 молекул.

Переходя к результатам проведённых исследований, необходимо констатировать, что были получены данные о том, что фуллерен С60 при внутрижелудочном введении крысам в условиях 28- и 92- дневного эксперимента, оказывал воздействия на некоторые показатели, характеризующие состояние организма животных, включая интегральные, биохимические и морфологические показатели. При токсикологической оценке значимости этих изменений следует принимать во внимание, во-первых, специфичность этих изменений, то есть возможность однозначно соотнести их с эффектом действия фуллерена, а не применявшегося носителя. Во-вторых, необходимо учитывать абсолютную величину направленности этих сдвигов, а также соотносить их с интервалами естественной вариабельности физиологической нормы изучаемых показателей. Это позволяет в каждом конкретном случае установить, можно ли считать выявленный статистически достоверный эффект как однозначно вредный (неблагоприятный), либо он может рассматриваться как адаптивная реакция здорового организма. В-третьих, существенно, является ли выявленный эффект дозозависимым, поскольку только в этом случае возможно однозначное установление максимальной недействующей дозы (МНД), которая могла бы быть в дальнейшем использована при разработке гигиенического норматива предела допустимого поступления наноматериала в организм.

Как показали результаты экспериментов, при 28-дневном введении фуллерена С60 отмечается дозозависимое снижение относительной массы печени. Данный эффект, однако, был нестойким, поскольку отсутствовал у животных, получавших те же дозы фуллерена в течение более длительного времени (92 дня) и, поэтому, не может рассматриваться как свидетельство подострого токсического действия. Гематологические и иммунологические показатели сыворотки крови крыс, исследованные в лаборатории спортивного питания с группой

алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН, старшим научным сотрудником, к.м.н. Трушиной Э.Н. и научным сотрудником, к.м.н. Мустафиной О.К., специфически характеризуют пероральное введение фуллерена С_б0 в организм животных, состоящее в его воздейтвии на лейкоцитарную формулу крови (возрастание числа нейтрофильных лейкоцитов максимально на 62%, эозинофилов на 69%, снижение общего числа лимфоцитов на 12%).

Как следует из анализа данных литературы, фуллерен С_б0 может проявлять в биологических системах свойства про- и антиоксиданта, в зависимости от условий эксперимента (в частности, от наличия освещения). Сразу необходимо отметить, что по условиям проведения эксперимента препараты фуллерена Сб0 вводили животным внутрь, содержали их при рассеянном дневном или искусственном освещении, в пластмассовых клетках, экранирующих значительную часть жёсткого УФ-компонента естественного освещения. Это позволяет предположить, что вероятность токсических эффектов, связанных с фотосенсибилизирующим действием фуллерена в условиях настоящего эксперимента была сведена к минимуму.

Исследования показателей ПОЛ, проведенные сотрудниками лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии ФГБУ «НИИ питания»

РАМН под руководством проф., д.м.н. Т.Б.Сенцовой, свидетельствовали об отсутствии усиления процессов ПОЛ, связанных с воздействием фуллерена С₆₀. Отсутствовали также какие-либо свидетельства усиления другого типа оксидантных процессов в организме, оцениваемых по показателю окислительного повреждения ДНК, в тесте экскреции 8-oxo-G (исследование проведено в лаборатории химии пищевых продуктов, младшим научным сотрудником Селифановым А.В.) и уровню тканевых тиолов.

Интересный эффект, характеризующий выраженное дозозависимое увеличение содержание селена в головном мозге животных, получавших фуллерен С60, по своей величине и направленности также не может однозначно рассматриваться, как признак неблагоприятного воздействия на организм. Связь между присутствием фуллерена С60 в организме крыс и аккумулированием селена в мозге, возможно, имеет сходство с теми механизмами, посредством которых эндоэдральные соединения, с помещенными во внутреннюю полость атомом или группой атомов, эффективно сохраняющих свою структру, благодаря химической и биологической инертности, обеспечиваемой оболочкой фуллерена, используются для целенаправленной тканеспецифической доставки [18]. Данная гипотеза говорит в пользу результатов, полученных в работе [176], в которой было установлено присутствие меченых фуллеренов в головном мозге и выдвинуто предположение об их проникновении через гематоэнцефалический барьер.

Отдельно следует остановиться на других, выявленных дозозависимых изменениях, которые со значительной степенью вероятности свидетельствуют о возможном токсическом действии фуллерена С60 на организм. Это, во-первых,

выявленное повышение проницаемости стенки тонкой кишки для макромолекул белка (ОВА) при 92-суточном введении фуллерена. Данный эффект следует рассматривать как безусловно неблагоприятный, т.к. ослабление барьерной функции тонкой кишки в отношении макромолекул способно привести к усилению транспорта во внутреннюю среду организма антигенов пищевых продуктов, токсинов микрофлоры белковой и липополисахаридной природы, что способно в дальнейшем привести к запуску каскада процессов, результатом которых может быть как аллергическая сенсибилизация, так и, в наиболее неблагоприятном случае - утрата барьерной функции в отношении кишечных микроорганизмов и развитие системного сепсиса [163, 11].

Во-вторых, необходимо проанализировать результаты изучения экспрессии клеточных маркеров воспаления в ткани печени, полученные с использованием метода конфокальной микроскопии. При интерпретации полученных данных, следует учитывать, что CD106 или VCAM-1 представляет собой белок суперсемейства иммуноглобулинов, участвующий в адгезии лейкоцитов с клетками эндотелия и в передаче клеточных сигналов, служащий посредником при адгезии лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов к клеткам эндотелия сосудов в подострой фазе воспаления [30]. Обычно он экспрессируется в стенках и крупных, и мелких кровеносных сосудов после стимуляции эндотелиоцитов цитокинами; таким образом, он может служить маркёром активации эндотелия цитокинами [41, 92]. CD31 или PECAM-1 - это мембранный гликопротеин суперсемейства иммуноглобулинов, относящийся к классу молекул клеточной адгезии и к подгруппе белков с ингибиторным ITIM-участком [121]. Он является общим маркёром нормального эндотелия [103, 171, 172]; в меньших количествах обнаруживается на циркулирующих тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и на некоторых популяциях Т-лимфоцтов. CD31 участвует в трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в острой фазе воспаления, ангиогенезе и активации интегринов. Кроме того, будучи клеточным

механорецептором, CD31 запускает каскад реакций эндотелиоцитов в ответ на растяжение под воздействием потока крови.

Проведенное методом конфокальной микроскопии исследование морфологии предполагаемых органов-мишеней воздействия фуллерена показало, что в дозе до 10 мг/кг массы тела в течение 3 месяцев какие-либо изменения в слизистой оболочке подвздошной кишки отсутствовали. Сохранялась нормальная морфология ворсинок, признаков воспаления не было отмечено, повышения уровня нейтрофилов в ткани не наблюдалось, межклеточные контакты и система актиновых микрофиламентов энтероцитов не были нарушены. Вместе с тем, по крайней мере, в наибольшей из использованных доз фуллерена Сб0, 10 мг/кг массы тела, с использованием метода конфокальной микроскопии были выявлены изменения в печени, состоявшие в увеличении численности и изменении распределения CD 106+ клеток с накоплением гранул в цитоплазме (Рисунок 16б- г, Рисунок 17в-д), что свидетельствовало, по-видимому, об активации клеток, предположительно идентифицируемых как Купферовские макрофаги, в отсутствие видимого воспаления и зон некроза. Этот эффект может свидетельствовать о развитии ранних стадий токсической реакции и является, тем самым, чувствительным биоиндикатором повреждающего действия вводимого фуллерена Сб0 на ткань печени.

Практически полное отсутствие накопления выявляемого методом ВЭЖХ фуллерена Сб0 в органах крыс было подтверждено также в остром эксперименте по введению дисперсии фуллерена Сб0 в изолированную петлю тонкой кишки крысы. При естественном (пероральном) пути поступлении фуллерена Сб0 возможна его биодеградация, или биотрансформация, что создает дополнительные сложности для точной оценки содержания фуллерена в том или ином органе живого организма. Возможной причиной этого является переход немодифицированной формы фуллерена в его полигидрокисилированные или другие производные, точный состав которых до сих пор не установлен, однако, нельзя искючить и того предположения, что при естественном (пероральном) пути поступления неизмененный фуллерен Сб0 накапливается в органах и тканях в

низких (недектируемых ВЭЖХ) количествах. Поэтому в отдельном эксперименте было изучено всасывание фуллерена С60, при введении фуллерена С60 в заведомо аггравированной дозе в изолированную петлю тонкой кишки крыс, то есть избегая влияния ферментных систем желудка и поджелудочной железы, которые также могут служить причиной биоконверсии фуллерена С60. Но и в этих условиях выявить проникновение и накопление фуллерена С60 во внутренних органах животных в пределах чувствительности использованного метода ВЭЖХ не удалось. С учетом выявленного количества фуллерена С60 в почке крысы, получавшей фуллерен С60 в дозе 10 мг/кг массы тела на протяжении 28 дней, которое составило около 450 нг, что соответствует порядка 0,016% от ежедневно вводимой дозы (для крысы средней массой около 270 г), в случае острого введения фуллерена в изолированную петлю кишки, с учётом чувствительности хроматографического метода анализа верхняя оценка его накопления в органе составила не более 35 нг, то есть менее 0,0015% от введённой дозы. Это значительно ниже имеющихся в литературных данных оценок, полученных с использованием изотопных методов. С целью устранения противоречия в имеющихся экспериментальных данных о выраженном системном биологическом действии этого соединения, с одной стороны, и отсутствии его накопления в значимых количествах в органах и тканях, с другой, был проведен эксперимент по исследованию стабильности фуллерена С60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro,задачами которого являлось подтверждение гипотезы о нестабильности фуллерена С60 в биологических средах с использованием модельных систем in vitro,воспроизводящих, с некоторой долей приближения, процессы, происходящие в организме после перорального введения этого соединения.

Полученные результаты объясняют имевшую место в ряде экспериментальных работ неудачу попыток количественного выявления фуллерена C60 in vivoпосле его перорального введения лабораторным животным и неоднозначность таких результатов при парентеральном и интратрахеальном введении. Одной из возможных причин является отсутствие унифицированного

протокола диспергирования, что снижает всасывание фуллерена в желудочно­кишечном тракте и ухудшает воспроизводимость детектируемых эффектов. Подавляющая часть фуллерена, всасывающегося в пищеварительном тракте (предположительно в составе смешанных мицелл жира и желчных кислот), подвергается быстрой биотрансформации с образованием метаболитов, не детектируемых методом ВЭЖХ. Данный процесс, как показали результаты проведенных тестов in vitro,является достаточно быстрым и, по-видимому, практически полностью завершается приблизительно через 1 сутки после введения вещества. По этим причинам выявить накопление фуллерена Сб0 в органах и тканях методом ВЭЖХ с толуольной экстракцией не удается.

Данные проведенных экспериментов не позволяют точно установить ферментные системы, ответственные за биотрансформацию фуллерена в организме. Можно предположить только, что к их числу не относится система микросомальных монооксигеназ, локализованных преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме и содержащихся in vitroв микросомальной фракции [2]. По этому показателю фуллерен С_б0, как можно предположить, отличается от липофильных ксенобиотиков родственной структуры, таких, например, как полициклические углеводороды, метаболизация которых происходит главным образом именно под действием микросомальных монооксигеназ [9].

Ввиду низких концентраций фуллерена, достигаемых в биологических тканях, выявление и идентификация этих предполагаемых метаболитов является сложной задачей, которая в перспективе может быть решена с использованием метода меченых атомов, а также масс-спектрометрии и других, современных метаболомных технологий.

В 28-дневном эксперименте с фуллеренолом Сб0(ОН)24 следует отметить, что его ежедневное, пероральное поступление в дозе 0,1 мг/кг массы тела и более вызывает ряд достоверных изменений в показателях организма крыс. Изменение массы надпочечников по абсолютной величине было достоверно выше на 12,5% у животных, получавших фуллеренол Сб0(ОН)24 в дозе 10 мг/кг, чем у контрольных

крыс, что возможно связано с их повышенной секреторной активностью и свидетельствует о хроническом стрессе на структурном уровне [16]. Из результатов исследований гематологических показателей сыворотки крови, проведенных в лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН старшим научным сотрудником, к.м.н. Трушиной Э.Н. и научным сотрудником, к.м.н. Мустафиной О.К., у животных получавших фуллеренол С60(ОН)24 в дозах 1 и 10 мг/кг массы тела, следует выделить увеличение процентного содержания моноцитов (на 39% и 42% соответственно) и относительного содержания незрелых гранулоцитов (на 96% и 145% соответственно), данные изменения были дозозависимыми и статистически достоверными (p