2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс- спектрометрии

В данном исследовании использовали прибор «Autoflex speed»

TOF/TOF (Bruker, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper

3.1.

Из суточной культуры дрожжей выделяли белковый экстракт, содержащий, в основном, рибосомальные белки.

3.1).

На сегодняшний момент база данных MALDI Biotyper содержит сведения о 5627 видах микроорганизмов, в том числе о более чем 120 видах Candida spp.

При исследовании нами клинических изолятов грибов рода Candida spp. использовали протокол полной экстракции белка с помощью этанола и муравьиной кислоты.

Суточную культуру исследуемого изолята Candida spp., полученную рассевом на чашке Петри с агаром Сабуро суспендировали в 300 мкл деионизированной воды в пробирке-эппендорфе, затем гомогенизировали смесь с помощью вортекса (Bio-San, Латвия) в течение минимум 1 минуты. Далее, к смеси в пробирку-эппендорф добавляли 900 мкл этанола и снова смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1 минуты, а затем центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин (Bio-San, Латвия). Образовавшуюся надосадочную жидкость полностью удаляли пипеткой. На следующем этапе к оставшемуся осадку добавляли

50 мкл 70% муравьиной кислоты и смешивали с помощью вортекса минимум в течение 1 минуты (70% муравьиную кислоту получали путем смешения 30 мкл дистиллированной воды и 70 мкл 100% муравьиной кислоты в чистой пробирке-эппендорф, перемешивая с помощью вортекса). Затем, к полученной смеси добавляли 50 мкл 100% ацетонитрила, смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1 минуты и снова центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/ мин. 1 мкл надосадочной жидкости наносили на 2 парные лунки 384 -луночной стальной полированной мишени, сушили при комнатной температуре (23

°С, 5 минут) и затем наносили 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4- гидроксикоричной кислоты) и сушили при комнатной тем пературе. Подготовленную мишень помещали в масс-спектрометр.

В качестве калибранта использовали тест-стандарт белкового экстракта E.coli. Процедуру калибровки и проверки выполняли на ячейке планшета, содержащей образец бактериального тест-стандарта.

Полученный масс-спектр анализировали на основе базы данных идентификации микроорганизмов MALDI Biotyper 3.1. Результат учитывали по данным значения коэффициента видовой идентификации. Использовали следующие критерии оценки результата MALDI-TOF масс- спектрометрии: коэффициент 1,79 – сомнительное определение рода [103, 164, 165, 167, 177, 182, 184].